海藻酸钠三维培养SW1353人软骨瘤细胞株:表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学特征及超微定位

背景:软骨细胞在体外单层培养的去分化改变及其来源困难是目前软骨细胞研究领域中的两大难题,目前关于SW1353人软骨瘤细胞表型和生物学特点及三维培养的相关报道较少.目的:观察SW1353人软骨瘤细胞在海藻酸钠三维培养体系中表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学及超微定位特点.设计、时间及地点:材料-细胞学体外观察,于2004-08/2006-01在中南大学湘雅医学院完成.材料:SW1353人软骨瘤细胞株由ATCC公司提供.方法:细胞复苏后接种,加入含胎牛血清、维生素C的DMEM培养基进行单层贴壁培养.离心后将细胞团块悬浮于低黏性海藻酸钠溶液中,细胞终浓度为2×10~9 L~(-1),滴入凝胶溶液,聚化获得细胞凝珠,每个凝珠约含20 000个细胞.藻酸盐凝胶三维体系培养8周后,柠檬酸钠分解凝胶,收获培养的软骨细胞及上清,并与单层培养的细胞进行比较.主要观察指标:细胞形态及表型变化,细胞生长曲线,细胞上清和海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达,细胞超微结构及Ⅱ型胶原的定位,同位素脉冲追踪活细胞Ⅱ型胶原的合成分泌.结果:①单层培养时,细胞由1周时的多角形变为8周后的条梭状或不规则形,三维培养条件下细胞形态始终以多角形为主.甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示,单层培养1周时均呈强阳性表达,8周后转为弱阳性,而三维培养8周后仍均呈强阳性表达.②三维培养条件下细胞生长曲线无明显增殖高峰,单层培养的细胞第8~10天达增殖高峰.③ELISA检测结果显示,单层培养8周后细胞上清中Ⅱ型胶原的表达明显高于第1周(P<0.05),同时也明显高于三维培养条件下细胞上清及海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达(P<0.05).④透射电镜下细胞超微结构基本正常,免疫电镜下可见细胞内Ⅱ型胶原主要定位于粗面内质网膜内,少数分布在线粒体.⑤~(14)C标记的脯氨酸干预后180 min,是细胞内合成及向细胞外分泌Ⅱ型胶原的高峰期.结论:SW1353人软骨瘤细胞在体外长期单层培养会发生细胞表型改变,其在藻酸盐凝胶三维培养体系中生长状态良好,细胞内软骨细胞标志物Ⅱ型胶原表达丰富,提示SW1353可以作为软骨细胞功能研究的良好模型.