| 构建和鉴定神经生长因子-β腺相关病毒穿梭质粒 |
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| 作者姓名： | 高大龙 解俊杰 李若飞 党晓谦 王坤正 杨雷刚 涂忠民 |
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| 作者单位： | 1. 咸阳市中心医院骨一科,陕西省,712000
2. 西安交通大学医学院第二附属医院骨一科 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目（30772189） |
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| 摘 要： | 目的 构建能够表达神经生长因子-β重组腺相关病毒穿梭质粒,为进一步包装腺相关病毒奠定基础.方法 利用高保真酶分别扩增pAAV-MCS的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连人T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,T4酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;培养人MIApaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人ngf-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-ngf-β；将ngf-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒.结果酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4250 bp、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白表达；质粒T-easy-ngf-β酶切可见3 kb、736 bp条带,测序显示基因序列正确；酶切pAAV-U6/CMV-ngf-β可见4300 bp、736 bp条带；质粒pAAV-U6/CMV-ngf-β测序显示载体中的基因序列正确.结论 成功构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒,包装表达神经生长因子的腺相关病毒,为进一步深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础.
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| 关 键 词： | 脊髓损伤 神经生长因子-β 腺相关病毒 穿梭质粒 |
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