重组人β-防御素-2基因COS-7细胞的转染表达

目的通过构建两种SV40系列的重组载体,即N端带Flag标签的重组hBD-2基因和C端带Myc和6xHis双标签的重组hBD-2,并转染COS-7细胞,探索建立既能持续有效地表达和分泌hBD-2、其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线.方法与结果(1)将hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的上游带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2,经DNA测序证明hBD-2cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(2)hBD-2全长cDNA片段插入编码双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+),构建出C端带Myc和6xHis双重标签的重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.DNA测序结果表明hBD-2cDNA片段插入方向和全长cDNA的碱基组成顺序均准确无误.(3)采用脂质体转染法分别将以上两种重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析hBD-2的表达情况.并检测经重组真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染细胞的可溶性蛋白及其培养上清的抗菌活性.(4)采用RT-PCR法对经带Flag报告基因的重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,结果扩增出一条约240bp的cDNA片段,其大小与预测相符.经Westernblot法检测到细胞可溶性蛋白在约10kD处有强反应条带显示.(5)用特异性引物(hBD2p6/hBD2p7)对经pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2转染的COS7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,经Westernblot法检测到细胞蛋白在约10kD处有强反应条带显示,其大小与该重组质粒结构中由pCMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量(10.1)相符.双层肉汤琼脂平板扩散法抑菌试验结果表明分别与正常COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清比较,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2的COS-7细胞的细胞可溶性蛋白及其培养上清在金黄色葡萄球菌质控菌株25923的平板上形成明显的抑菌环.结论(1)N端带Flag标签基因重组真核表达载体pCMV.tag2B/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法和Westernblot法证实hBD-2基因已在COS-7细胞内持续有效地表达.(2)C端带双重标签基因Myc和6xHis的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2已被成功构建和转染COS-7细胞.通过RT-PCR法、Westernblot法和体外抗菌实验证实,该系统不仅能有效地表达和分泌具抗菌活性hBD-2,也为其表达产物的检测、分离纯化提供了必要条件.