| 摘 要： | 目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术, 对人单核细胞分泌的TNF-α mRNA进行定量检测。方法:设计两条特异探针, 其中一条为捕获探针, 5'端带有氨基修饰, 可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合, 而且是"竖直"地包被在微孔内, 另一个为检测探针, 3'端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA, RT-PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中, 加入检测探针与已杂交的产物结合, 最后加入亲和素-辣根过氧化物酶(avidin－HRP)显色系统催化底物显色, 450 nm波长下检测吸光度进行定量。结果:该方法检测TNF-αmRNA的灵敏度, 明显高于琼脂糖凝胶电泳, 而且具有良好的重复性, 等量PCR产物作10个复孔, 吸光度的CV值为7.2%, 批间的CV值为9.1%。在本实验中, 我们首次尝试着用客观的数据来表示正常人中1×106个PBMCs中TNF－αmRNA的平均表达量, 发现该表示方法直观明了, 结果稳定, 而且简便可行, 不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论:本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作, 结果数据化等优点, 适合于微量细胞因子mRNA的定量检测。
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