冻融后2-细胞胚胎发育至囊胚建立人胚胎干细胞系

目的 用解冻后废弃胚胎及部分患者捐献的冷冻胚胎建立胚胎干细胞系.方法 用程序解冻法解冻2001-2007年来我生殖中心就诊的患者剩余冷冻胚胎,培养至囊胚,Pronase酶去除透明带后,全囊胚置于小鼠饲养层(MEF)中培养获得原代细胞,机械法结合Ⅳ型胶原酶消化法传代,并利用细胞形态观察、免疫荧光染色、核型分析、畸胎瘤切片胚层分析方法对所建胚胎干细胞系进行鉴定.结果 序贯培养23枚废弃胚胎,有4枚培养到囊胚阶段;去除透明带后有2枚在MEF上贴壁生长,但只有1株成功扩增稳定传代至第80代;细胞集落呈典型的鸟巢状,有稳定的46XY核型;细胞系表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81抗原,RT-PCR检测有Nanog、Oct-4、Sox2等基因表达;同时在体外能分化为内、中、外3个胚层.结论 解冻后2～3细胞Ⅲ～Ⅳ级的废弃胚胎仍具有发育形成囊胚的潜能,并利用所得囊胚采用酶去透明带全胚培养法能建立稳定增殖的hESC细胞系.