ERα AF-1区磷酸化位点突变体的构建及对ERα活性的影响

目的：构建雌激素受体(ERα) AF1区丝氨酸（Ser）磷酸化位点104、106、118和167位基酸的4个突变体，并在哺乳动物细胞293T中检测突变后对其活性的影响。方法：以pcDNA3-ERα为模板，用重组PCR的方法扩增出编码这4种突变体的基因片段，再将这些片段以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG编码序列融合。用Western blotting检测融合蛋白的表达，并在哺乳动物细胞293T中检测这些突变体突变后对ERα活性的影响。结果：成功构建了ERα AF1区丝氨酸磷酸化位点104、106、118和167位氨基酸的4个突变体，并在293T细胞中得到表达。活性测定结果表明，在不加雌激素(E2)的情况下，ERα及其突变体的转录活性分别是空载体pcDNA3的3.40 、3.21 、3.02 、3.00和3.54倍；在雌激素的作用下，104、106位氨基酸的突变体对ERα的活性无影响,而118和167位氨基酸的突变体的活性值是ERα的50%。结论：在104、106、118和167这4个ERα AF1区磷酸化位点中，只有118和167位点的丝氨酸的磷酸化是雌激素调节靶基因转录过程中所必需的。