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| 果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点 | |
| 引用本文： | 冯昌增,谢月辉,曹彩,孟照辉.果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点[J].海峡预防医学杂志,2012,32(3). |
| 作者姓名： | 冯昌增 谢月辉 曹彩 孟照辉 |
| 作者单位： | 1. 昆明医学院第一附属医院分子心血管病研究室 昆明650032;中国医学科学院医学生物学研究所 昆明650118 2. 昆明医学院基础医学院 昆明650031 3. 云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室 昆明650091;贵州省烟草科学研究所 贵阳550081 4. 昆明医学院第一附属医院分子心血管病研究室 昆明650032 |
| 基金项目： | 国家自然科学基金，云南省中青年学术技术带头人后备人才，云南省教育厅重大专项，云南省科技计划项目 |
| 摘 要： | 吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CRs)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要管家蛋白,其主要的功能是催化吡咯啉-5-羧酸(P5C)转化为脯氨酸,同时将NAD(P)H氧化为NAD(P)+.为揭示果蝇P5CR的聚合形式、酶学性质及晶体结构,提取了果蝇的总RNA,通过逆转录获得了cDNA,进而通过PCR获得了编码果蝇P5CR的cDNA片段；将此片段连接到pET-28a(+)载体上,在大肠杆菌(Escherichia coli)中得到了高效表达,依次经过硫酸铵分级沉淀、亲和层析及凝胶过滤层析得到了适合晶体生长的高纯度蛋白；通过EGS交联实验和凝胶过滤层析检测了P5CR在溶液中的聚合形式；应用分光光度法测定了果蝇P5CR的酶活性参数；采用悬滴气相扩散法筛选了P5CR的结晶条件并进行了优化.实验结果:(1)纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE检测,结果显示,凝胶上已基本观察不到杂蛋白质条带,说明目的蛋白质纯度较高；(2)果蝇P5CR在溶液中的基本存在形式是十聚体,在此基础上可形成更大的聚合形式；(3)果蝇P5CR参与抗癌药物硫代脯氨酸的代谢,在该逆向反应中最适pH为高碱性,该酶在45℃的半衰期约15分钟；(4)筛选得到了果蝇P5CR的初步结晶条件(0.2mol/L Ammonium phosphate dibasic,20％ PEG3350 pH 8.0). |
| 关 键 词： | 果蝇 吡咯啉-5-羧酸还原酶 同源多聚体 结晶 |
Purification and Characterization of Pyrroline-5-carboxylate Reductase from Drosophila melanogaster |
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| FENG Chang-zeng , XIE Yue-hui , CAO Yi , MENG Zhao-hui.Purification and Characterization of Pyrroline-5-carboxylate Reductase from Drosophila melanogaster[J].Strait Journal of Preventive Medicine,2012,32(3). | |
| Authors: | FENG Chang-zeng XIE Yue-hui CAO Yi MENG Zhao-hui |
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| Keywords: | |
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