血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究

目的:通过构建人血管能抑制素(Canstatin)真核表达载体,转染裸鼠肿瘤局部,探索其对肺癌治疗作用.方法:RT-PCR法获取Canstatin cDNA全长,定向克隆法构建Canstatin基因表达载体pCMV-Script-Cans.荧光定量PCR法检测转染细胞Canstatin mRNA的表达.台盼蓝拒染法、3H-TdR掺入法检测细胞生长增殖,TUNEL法检测细胞凋亡.基因枪转染重组载体到荷瘤裸鼠肿瘤局部,CD31单克隆抗体微血管记数检测抗血管生成效应.结果:成功构建pCMV-Script-Cans重组载体,并在转染的细胞株中检测到Canstatin mRNA的表达.人脐静脉内皮HUV-EC-C细胞株pCMV-Script-Cans质粒转染组比空载体组3H-TdR掺入量明显减低(P＜0.01),细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),重组载体转染肿瘤生长缓慢,微血管数显著低于对照组(P＜0.01).结论:pCMV-Script-Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达Canstatin,并抑制内皮细胞增殖,而且有很好的抗肺癌血管生成作用.     

Canstatin分泌增强体系的建立及其抗肺癌作用

目的:评估canstatin分泌增强体系在不同氧条件下的生物学效应,观察其对裸鼠肺癌模型的抗肿瘤作用。方法:基因重组技术构建canstatin分泌型载体,将其转染肿瘤细胞观察其在不同氧条件下的canstatin mRNA表达量,稳定转染的肺癌细胞与人脐静脉内皮细胞混合培养,观察混合培养对内皮细胞增殖、凋亡的效应。建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将此体系转染荷瘤裸鼠,观察其对裸鼠移植瘤血管生成的作用,及肿瘤体积重量等指标,评估其抗肺癌效果。结果:成功构建canstatin缺氧增强分泌体系。缺氧条件下其转染的肺腺癌A549细胞canstatin mR-NA的表达显著增加。其稳定转染的A549细胞与人脐静脉内皮细胞HUVEC混合培养可使HUVEC生长增殖缓慢并大量凋亡,此体系转染的裸鼠移植瘤生长缓慢,瘤重、瘤体积及血管生成均显著低于对照组。(P<0.01)。结论:canstatin分泌增强体系在缺氧条件下能显著增加目的基因表达量及其生物学效应,并具有显著抑制肺癌生长和血管生成的作用。     

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的: 克隆并表达canstatin基因，初步检测其抑制血管生成的活性。方法: 采用RTPCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA，克隆入pMD18T载体中，并测序鉴定。在QIA表达系统中表达，Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果: 经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致，重组进pQE30表达载体，IPTG诱导表达并纯化成功，表达产物能明显抑制血管生成。结论: 成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）实验中具有明显抑制血管生成活性     

人canstatin基因原核载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的：构建人血管能抑素canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法：从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增canstatin cDNA,克隆进质粒pUCm-T,转化E coli DH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-22b（＋）,转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因canstatin长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pUCm-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出6个白色菌落做酶切鉴定.其中一个菌落被证实为阳性克隆,测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的canstatin基因序列完全一致.将canstatin cDNA,插入质粒pET-22b（＋）,转化E.coli BL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量24000左右出现新的蛋白表达条带,诱导1、2、3、4 h后,表达蛋白分别占菌体总蛋白的18.2%、18.8%、23.0%和23.4%.将诱导3 h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125和250 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论：成功构建人canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出canstatin重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.     

血管能抑素诱导甲状腺癌细胞SW579凋亡和衰老及其机制

目的：检测血管能抑素（ canstatin）对甲状腺癌SW579细胞的增殖抑制、诱导凋亡与衰老作用及其机制。方法：利用软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖。分别利用Annexin V-FITC/PI双染和β-半乳糖苷酶染色检测细胞凋亡和衰老。Western blot技术检测可能的机制。结果：Canstatin可以明显抑制SW579细胞增殖,诱导其凋亡和衰老。处理后细胞的p-AKT蛋白水平明显下降。而caspase 3和9蛋白水平升高。结论：Can-statin通过抑制p-AKT导致SW579细胞凋亡和衰老。     

重组人血管能抑制素分泌型表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建表达分泌型人血管能抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,观察其生物学效应。方法　以SOEPCR法将canstatin及癌胚抗原 (CEA)引导肽cDNA体外连接 ,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上 ,脂质体介导转染HUVEC及A5 4 9细胞 ,荧光定量PCR法检测转染细胞canstatin基因表达量 ,并采用多种方法检测该重组载体的生物学活性。结果　成功构建canstatin分泌型载体 ,在其转染的肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞中均检测到不同拷贝数的表达。转染后HUVEC生长增殖缓慢 ,出现G0 ～G1期阻滞并伴有大量凋亡 ,与空载体转染组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;而A5 4 9细胞转染后与空载体转染组在以上几个方面差异均无统计学意义 (P >0 0 5 )。重组载体转染A5 4 9细胞上清液干预的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成明显减少 ,且颜色苍白、轮廓模糊 ,空载体转染组和未干预组血管生长旺盛、脉络清晰。结论　SOE法构建的含有CEA引导肽的canstatin分泌型表达载体能在转染的内皮细胞及肺癌细胞中稳定表达 ,可有效抑制内皮细胞生长增殖并诱导凋亡。重组载体转染的细胞可分泌有生物学活性的canstatin。     

Patent focus on cancer chemotherapeutics. II Angiogenesis agents: April 2000 - September 2000

Angiogenesis refers to the formation of capillary blood vessels from existing blood vessels: a process that is believed to be critical for tumour growth and metastasis. Angiogenesis inhibition represents a new approach to cancer chemotherapy with several agents and approaches now entering late clinical development. This review summarises the key aspects of recent patent applications referring to inhibitors of angiogenesis that have been published between April and September 2000. The review covers the main mechanism-based approaches such as MMPI, integrin antagonists, urokinase inhibitors and inhibitors of the growth factor signalling pathways of fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and Tie-2/Tek. Applications referring to endogenous inhibitors such as endostatin or angiostatin are also included, as are selected natural products that have data suggesting a link to angiogenesis-specific mechanisms of action.     

Canstatin基因表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建可表达人血管生成抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,探索canstatin对人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)和人肺腺癌A5 49细胞株的生物学效应。方法　RT PCR法从胎儿肝组织中获取canstatincDNA全长 ,并将其克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上。阳离子脂质体介导该重组载体转染HUVE细胞系、A5 49细胞株。RT PCR法检测其对canstatinmRNA的表达。台盼蓝拒染法活细胞记数 ,3 H TdR掺入法检测细胞增殖 ,TUNEL法检测细胞凋亡 ,流式细胞术检测细胞周期。结果　成功构建pCMV Script Cans真核表达重组载体 ,并在转染该表达载体的A5 49及HUV EC C细胞株中均检测到canstatinmRNA的表达。HUV EC C细胞株pCMV Script Cans载体转染组比空载体组 3 H TdR掺入量明显减低(P <0 0 1) ,细胞凋亡率明显增加 (P <0 0 1) ,A5 49细胞株转染组与空载体组 3 H TdR掺入量无显著差异 (P >0 0 5 ) ,细胞凋亡率无显著差别 (P >0 0 5 )。结论　pCMV Script Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达canstatin ,并抑制内皮细胞增殖 ,诱导内皮细胞凋亡 ,但对肿瘤细胞没有直接抑制作用。     

含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建

目的:构建含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。方法:采用RT-PCR的方法,获得含有人canstatin的cDNA片段以及分别在5’UTR下游和3’UTR上游添加了翻译增强序列(UUAACUUUA)的人canstatin cDNA片段,将得到的目的片段分别连接到PMD18-T载体上,利用该载体将目的片段连接到荧光素酶基因Lux Ct表达盒中并进行酶切鉴定。结果:RT-PCR分别得到约700 bp的cDNA片段并克隆到PMD18-T载体上。用PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切Lux Ct质粒,得到2 100 bp和10 000 bp的2条片段。然后,将大片段回收后分别与上一步得到的cDNA片段进行连接,酶切鉴定结果显示含有翻译增强序列的人canstatin片段成功插入到Lux Ct质粒中。结论:成功构建了含有翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。