canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的　肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法　将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果　canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论　canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。     

缺氧诱导Canstatin基因表达实验研究

目的构建Canstatin基因缺氧表达增强体系，观察其在常氧与缺氧条件的基因表达量和生物学效应。方法定向克隆法构建含有缺氧反应元件（HRE）的Canstatin基因表达载体，荧光定量PCR法检测转染细胞在常氧和缺氧条件下Canstatin mRNA表达量，流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡，电镜下观察内皮细胞超微结构的改变。结果成功构建Canstatin缺氧增强表达体系。缺氧条件下该体系转染的细胞Canstatin mRNA的表达显著增强。该体系转染后人脐静脉内皮细胞出现G0-G1期阻滞并伴有大量细胞凋亡，电镜下观察到典型的凋亡改变。结论Canstatin缺氧表达体系在缺氧条件下表达量及生物学效应显著增强。     

慢病毒介导的Canstatin基因转移对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：构建携带Canstatin基因的慢病毒载体,体外转染脐静脉血管内皮细胞ECV304,观察其体外培养的脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响。方法：应用基因重组技术构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Canstatin,通过酶切、测序验证Canstatin基因后,将pGC-FU-Canstatin质粒和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Canstatin基因重组慢病毒GC-FU-Cansta-tin,并测定病毒滴度。将重组慢病毒转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞ECV304,通过Western blotting检测靶细胞中Canstatin的表达。采用MTT法观察Canstatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。TUNEL染色、流式细胞仪AnnexinV/碘化丙啶双染法,检测慢病毒介导的Canstatin基因诱导脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果：pGC-FU-Canstatin中携有正确的Canstatin基因序列;pGC-FU-Cansta-tin和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染包装细胞293T产生重组病毒GC-FU-Canstatin;检测病毒滴度为1×109TU/ml;Western blotting检测到Canstatin蛋白在靶细胞中持续表达。Canstatin（感染复数分别为25和50）作用72h后,ECV304细胞增殖数目显著少于PBS组和空载体组（P〈0.01）;TUNEL染色,以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Canstatin作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后,出现典型的凋亡形态学改变。以感染复数为25的GC-FU-Canstatin处理ECV304细胞72h后,细胞凋亡率为（21.63±1.32）%,PBS组为（2.87±0.76）%,空载体组为（2.66±0.69）%,转基因组与空载体组、PBS组相比差异均有显著统计学意义（P〈0.01）。结论：慢病毒介导的Canstatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有促诱导作用。     

Effects of recombinant human canstatin protein in the treatment of pancreatic cancer

INTRODUCTION The prognosis of patients with pancreatic cancer is poor, with or without treatment. The American National Cancer Institute (NCI) reported in its SEER Cancer Statistics Review that there are approximately 27 000 new cases of pancreatic cancer…     

血管生成抑制剂Canstatin联合豆蔻提取物治疗荷瘤裸鼠实验研究

目的：探讨canstatin联合豆蔻提取物对人胃癌细胞株SGC-7901胃癌模型裸鼠肿瘤生长的影响。方法：建立裸鼠原位移植人胃癌模型,将模型裸鼠随机分为Canstatin组、豆蔻提取物组、联合用药组,同时设立对照组,对原位种植胃癌的体积和抑瘤率、肿瘤微血管密度进行观察,行凋亡指数检测。结果：豆蔻提取物组、Canstatin组、联合用药组的抑瘤率分别为28．8％、38．9％、44．1％;豆蔻提取物组、Canstatin组、联合用药组、对照组的肿瘤微血管密度（MVD）分别为23．81±8．15、21．50±9．17、19．01±7．15、29．45±6．72。结论：豆蔻提取物与Canstatin均可以抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长,促进移植瘤细胞的凋亡,降低肿瘤微血管密度,但以联合作用效果显著。     

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:从小鼠肝脏组织克隆canstatin cDNA并在大肠杆菌(E.coli)中表达, 为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法: 用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin(m canstatin)的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin cDNA 定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中, 在大肠杆菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达。结果:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin的cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中表达。结论: 首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA, 其原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。     

信号肽-canstatin真核表达载体的构建及其在Eca-109细胞中的分泌表达

目的：构建信号肽-canstatin 真核表达载体并在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。 方法： 利用点突变技术将小鼠纤溶酶原信号肽(SP)序列插入到载体pEGFP-C1 EGFP编码序列起始密码的后面,构建pEGFP-C1-SP载体。以pMD18T-Can为模板, 扩增小鼠canstatin基因，构建信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can。用脂质体转染法瞬时转染人食管癌细胞Eca-109。利用Western blotting检测小鼠canstatin 融合蛋白在Eca-109细胞中的分泌表达。 结果：DNA测序证明所构建的带信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP正确;酶切和DNA测序表明信号肽-canstatin 分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can构建正确, EGFP-canstatin融合蛋白在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。 结论： 获得了能分泌canstatin融合蛋白的真核表达载体，并分泌到人食管癌细胞Eca-109的细胞外, 为小鼠canstatin的功能研究及应用于基因治疗提供了实验基础。     

重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤的实验研究

目的探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物氟尿嘧啶（5-FU）联合应用治疗结肠癌的效果,以期探索结肠癌治疗新途径。方法结肠癌SW-480细胞（1×107/只）注射到30只裸鼠皮下,建立结肠癌皮下移植瘤模型。当肿瘤长至2--3 mm时,随机分6组。给药途径均为腹腔注射给药。治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小。疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD31免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度（MVD）。结果①各试验组肿瘤的生长明显受到抑制,瘤体质量明显低于对照组（P〈0.01）。5-FU＋Canstatin组低、高浓度联合治疗组抑瘤作用较对照组明显增强（P〈0.05）,其瘤重抑制率分别为74.76%和82.04%。②免疫组化：5-FU＋Canstatin组低浓度组（22.6±3.6）和5-FU＋Canstatin组高浓度组（15.0±2.8）治疗小鼠肿瘤组织内MVD显著低于对照组（36.4±5.6）和5-FU治疗组（31.2±4.0）（P〈0.05）,而5-FU治疗组与对照组间差异无统计学意义;③不良反应：各实验组未观察到明显毒性反应。结论重组人Canstatin蛋白能有效抑制人结肠癌生长,无明显毒副作用,为结肠癌治疗提供了新的有力的治疗方法。     

慢病毒介导的Canstatin基因转移对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建携带Canstatin基因的慢病毒载体,体外转染脐静脉血管内皮细胞ECV304,观察其体外培养的脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用基因重组技术构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Canstatin,通过酶切、测序验证Canstatin基因后,将pGC-FU-Canstatin质粒和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Canstatin基因重组慢病毒GC-FU-Cansta-tin,并测定病毒滴度。将重组慢病毒转染靶细胞人脐静脉血管内皮细胞ECV304,通过Western blotting检测靶细胞中Canstatin的表达。采用MTT法观察Canstatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。TUNEL染色、流式细胞仪AnnexinV/碘化丙啶双染法,检测慢病毒介导的Canstatin基因诱导脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果:pGC-FU-Canstatin中携有正确的Canstatin基因序列;pGC-FU-Cansta-tin和包装质粒pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染包装细胞293T产生重组病毒GC-FU-Canstatin;检测病毒滴度为1×109TU/ml;Western blotting检测到Canstatin蛋白在靶细胞中持续表达。Canstatin(感染复数分别为25和50)作用72h后,ECV304细胞增殖数目显著少于PBS组和空载体组(P<0.01);TUNEL染色,以MOI为25的重组慢病毒GC-FU-Canstatin作用于人脐静脉血管内皮细胞ECV304细胞72h后,出现典型的凋亡形态学改变。以感染复数为25的GC-FU-Canstatin处理ECV304细胞72h后,细胞凋亡率为(21.63±1.32)%,PBS组为(2.87±0.76)%,空载体组为(2.66±0.69)%,转基因组与空载体组、PBS组相比差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论:慢病毒介导的Canstatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有促诱导作用。