Involvement of adenylate cyclase and protein kinase C in the α2-adrenoceptor-mediated inhibition of noradrenaline and 5-hydroxytryptamine release in rat hypothalamic slices

Summary In superfused rat hypothalamic slices prelabelled with [³H]-noradrenaline, the ₂-adrenoceptor agonist UK 14304 inhibited in a concentration-dependent manner the electrically-evoked release of tritium. This inhibition was antagonized by the ₂-adrenoceptor blocking agent idazoxan, which by itself increased the electrically-evoked tritium overflow. Exposure to forskolin, an adenylate cyclase activator, increased the electrically-evoked release of [³H]-noradrenaline. In the presence of forskolin (1 mol/l), both the inhibitory effect of UK 14304 and the increasing effect of idazoxan on the electrically-evoked release of [³H]-noradrenaline were less pronounced than in the absence of the adenylate cyclase activator. Exposure to forskolin and to the phosphodiesterase inhibitor 3-isobutyl-l-methylxanthine shifted to the right the concentration-effect curve for UK 14304 in a similar manner as that observed in the presence of forskolin alone. Exposure to phorbol-12,13-dibutyrate (0.01–10 mol/l), a drug which activates protein kinase C, increased the electrically-evoked release of [³H]-noradrenaline. In the presence of phorbol-12,13-dibutyrate (0.1 and 1 mol/l), the concentration effect curve for UK 14304 on tritium overflow was significantly shifted to the right. The increasing effect of idazoxan on tritium overflow was significantly less pronounced in the presence of 1 mol/l phorbol-12,13-dibutyrate.In superfused rat hypothalamic slices prelabelled with [³H]-5-hydroxytryptamine, the ₂-adrenoceptor agonist UK 14304 significantly inhibited the electrically-evoked release of tritium. Exposure to forskolin increased in a concentration-dependent manner [³H]-5-hydroxytryptamine overflow, but did not modify the UK 14304-mediated inhibition. Exposure to 3-isobutyl-1-methylxanthine enhanced the electrically-evoked release of [³H]-5-hydroxytryptamine. In the presence of both forskolin (1 mol/l) and 3-isobutyl-l-methylxanthine (1 mmol/l), the concentration-response curve for UK 14304 was significantly shifted to the right. Exposure to phorbol-12,13-dibutyrate (0.01–10 mol/l) enhanced in a concentration-dependent manner the electrically-evoked overflow of [³H]-5-hydroxytryptamine. In the presence of phorbol-12,13-dibutyrate (0.1 and 1 mol/l), UK 14304 was significantly less potent to inhibit tritium release than in the absence of the protein kinase C activator.It is concluded that both cyclic AMP and phosphoinositide turnover are involved in the modulation of noradrenaline and 5-hydroxytryptamine release by presynaptic ₂-adrenoceptors in rat hypothalamic slices. However, these interactions do not represent definitive proof for a cause-effect relationship for the second messengers mediating the ₂-adrenoceptor induced inhibition of transmitter release either as autoreceptor or as heteroreceptor.Send offprint requests to S. Z. Langer at the above address     

红花组分HSYA对人胃腺癌BGC-823移植瘤裸鼠VEGF蛋白、KDR与缺氧诱导因子表达的影响

目的:研究红花组分羟基红花黄色素A(HSYA)对人胃腺癌皮下移植瘤裸鼠血管内皮生长因子(VEGF)蛋白、含激酶插入区受体(KDR)和缺氧诱导因子(HIF-1α)mRNA与蛋白表达的影响。方法:采用BALB/C nu/nu裸小鼠接种人胃腺癌细胞株BGC-823于右前肢腋部皮下建立裸鼠人癌移植瘤模型,随机分为模型组、对照组、HSYA高、低剂量组(0.056g/L、0.028g/L),观察抑瘤作用,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤组织VEGF与HIF-1α蛋白以及血清VEGF蛋白表达;蛋白印迹(Western blotting)法测定瘤组织KDR磷酸化蛋白的表达;实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)法检测瘤组织KDR及HIF-1αmRNA表达。结果:HSYA低剂量组抑瘤明显,该组瘤组织及血清VEGF蛋白表达降低,瘤组织KDR磷酸化蛋白表达减弱,与模型组比较差异明显(P0.05,P0.01);HIF-1α蛋白表达较模型组瘤组织明显减少(P0.01)。KDR mRNA表达与模型组相比减弱,差异有统计学意义(P0.05)。结论:一定浓度的HSYA抑制肿瘤生长的可能机制与抑制VEGF、HIF-1α蛋白的表达,减弱KDR蛋白磷酸化及其基因表达,从而抑制内皮细胞活化阻碍肿瘤血管新生以及降低肿瘤缺氧微环境对血管生成的诱导有关。     

P －gp 在人胃癌干细胞中表达的初步研究

目的：通过无血清法富集人胃癌 BGC －823干细胞,并对所获得的 BGC －823干细胞生物学特性进行研究。方法：采用无血清悬浮培养方法富集人胃癌 BGC －823干细胞球。后续实验分为 BGC －823干细胞组和 BGC －823细胞组：采用蛋白印迹（Western Blot）法和 Hoechst33342染色法对所富集细胞的干性进行鉴定;利用平板克隆实验检测细胞单克隆形成能力;采用 CCK －8法检测细胞对紫杉醇的敏感性;RT －PCR 法检测 P －gp mRNA 的表达;细胞免疫荧光双染观察干细胞球 CD44、P －gp 的表达情况。结果：采用无血清悬浮培养法成功获得干细胞球。CCK －8结果显示,BGC －823干细胞对紫杉醇敏感性较 BGC －823细胞降低（P ＜0．05）。干细胞球单克隆形成能力较人胃癌 BGC －823细胞增强（P ＜0．05）。Western Blot 和 Ho-echst33342染色法结果显示无血清富集的细胞为胃癌干细胞。RT －PCR、细胞免疫组化检测显示 BGC －823干细胞 CD44、P －gp 的表达较 BGC －823细胞升高,统计学差异明显（P ＜0．05）。结论：利用无血清富集法收集的人胃癌 BGC －823干细胞球为研究干细胞的理想模型,胃癌干细胞的形成是耐药出现的潜在机制。     

硫氧还蛋白1对胃癌细胞系BCG823生长的影响

目的探讨硫氧还蛋白1（thioredoxin-1,Trx1）对胃癌细胞系细胞周期及增殖速度的影响。方法对BCG823、AGS、MNK45、NUGC3、PHM82五种胃癌细胞系的质粒转染效率进行测定,选择出转染效率高的细胞系;并用实时PCR（RT-PCR）测定胃癌细胞系中Trx1的表达水平,选择出表达较低的细胞系。将所构建的Trx1真核重组表达载体pcDNA3.1myc-His-Trx1转染入上述实验筛选出的胃癌细胞系,使细胞中Trx1过表达,用流式细胞仪检测过表达Trx1的胃癌细胞进入S期的比例。结果 BCG823、AGS两种细胞系的转染效率高,满足实验需要。BCG823的Trx1表达较AGS低[BCG823细胞系的ΔCT（Trx-GAPDH）=1.43,AGS细胞系的ΔCT（Trx-GAPDH）=1.10,ΔCT值与表达量成反比],选择BCG823作为实验对象。转染pcDNA3.1myc-His-Trx1的细胞Trx1表达升高（与内参蛋白的比值为0.45±0.02和0.26±0.03,n=3,t=9.127,P=0.000）,进入S期的细胞比例升高（转染带有Trx1质粒的细胞进入S期的比例为28.54%,而转染了空载体者进入S期的比例为22.24%,χ2=104.759,P=0.000）。结论 Trx1表达水平上调可以促进胃癌细胞进入S期。     

香菇多糖联合多西他赛对胃癌BGC823细胞增殖的影响

目的：观察香菇多糖单药及联合多西他赛抑制胃癌细胞BGC823增殖的作用.方法：分别用不同浓度的香菇多糖、多西他赛和香菇多糖联合多西他赛处理胃癌细胞BGC823.香菇多糖终浓度分别为1.560μg/ml,3.125 μg/ml,6.250 μg/ml,12.500μg/ml.多西他赛终浓度分别为0.625 μg/ml,1.250μg/ml,2.500μg/nl,5.000 μg/ml.MTT法检测各组细胞增殖情况;同时用Annexin Ⅴ/PI法检测各组细胞的凋亡.结果：单药香菇多糖能抑制BCG823细胞的增殖,不同浓度（由高到低）对BGC823细胞的增殖抑制率分别为67.7％,56.0％、42.1％和23.2％,与阴性对照组比较有统计学意义（P＜0.05）.不同浓度香菇多糖联合多西他赛能增强多西他赛对BGC823细胞增殖的抑制作用.单药香菇多糖能增加BGC823细胞的细胞凋亡率,与多西他赛联用使细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）.结论：香菇多糖能抑制胃癌BGC823细胞的增殖,并能显著增强多西他赛抑制胃癌细胞BGC823的增殖作用.     

竹节香附素A对人胃癌细胞株BGC-823细胞周期及STAT3信号通路的影响

目的?研究竹节香附素A(Raddeanin A,RA)在体外对胃癌细胞BGC-823的周期阻滞作用及对STAT3信号通路的影响。方法?应用MTT法检测RA对人低分化细胞BGC-823细胞的增殖影响,应用流式细胞仪检测RA对BGC-823细胞周期的阻滞作用,细胞划痕实验检测RA对BGC-823迁移、侵袭能力的影响,应用Western blot检测其对STAT3信号通路的影响。结果?RA在给药12、24、48h后,与对照组相比,对BGC-823细胞的增殖抑制有显著效果,呈现时间-浓度依赖关系。流式细胞周期结果显示,RA作用于人胃癌细胞BGC-823 12h后,S期比例与对照组相较显著上升,而G₂/M期比例下降,表明细胞被阻滞于S期。在浓度为8、16μmol/L时,镜下显示迁移过去的胃癌细胞数目均明显低于对照组,Western blot结果显示RA能下调p-STAT3蛋白的表达。结论?RA能有效抑制人胃癌细胞的增殖并阻滞其细胞周期于S期,并且抑制STAT3信号通路中p-STAT3的表达。      

DADS通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路增强沉默LIMK1抑制人胃癌BGC823细胞迁移侵袭

探讨二烯丙基二硫(DADS)通过Rac1/LIMK1/cofilin1通路对沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭的影响。划痕实验和侵袭实验观察迁移和侵袭能力;RT-PCR、Western blot、免疫组化检测LIMK1、Rac1、Rock1、Pak1与Cofilin1和p-Cofilin1表达。结果显示,DADS处理沉默组疤痕距离较对照组和沉默组增加(P<0.05)。DADS处理沉默组穿膜细胞低于对照组、空载体组与沉默组(P<0.05) 。沉默组LIMK1表达低于对照组和空载体组,DADS后,各处理组低于处理前各组(P<0.05)。并且,沉默组、对照组和空载体组的Rac1、Rock1、Pak1与p-cofilin1表达下调 (P<0.05)。表明DADS可增强沉默LIMK1抑制BGC823细胞迁移侵袭,机制可能与阻断Rac1/LIMK1/cofilin1通路有关。     

胃泌素及其受体拮抗剂对BGC－823细胞系生长的调节

本文用液闪测定和细胞计数观察了胃泌素及其受体拮抗剂丙谷胺和Ｌ－３６５２６０对体外培养的人胃腺癌ＢＧＣ－８２３细胞系的生长调节作用。结果表明不同浓度胃泌素对ＢＧＣ－８２３细胞系的生长均有显著促进作用，而这种作用可被其受体拮抗剂丙谷胺和Ｌ－３６５２６０所抑制，且发现在胃泌素浓度衡定时，Ｌ－３６５２６０对ＢＧＧ－８２３细胞系的生长抑制作用明显强于丙谷胺。这一结果也提示，Ｌ－３６５２６０对胃泌素受体的亲合力可能明显高于丙谷胺。     

佛波酯不同浓度和不同时间对人胃癌BGC823细胞的MMP-9表达

目的 观察佛波酯(12-myristate 13-acetate,PMA)不同浓度和不同时间对人体胃癌BGC823细胞MMP-9表达的影响,探讨PMA能诱导MMP-9表达增加的最佳浓度和诱导时间.方法 采用mRNA(Real Time RT-PCR)蛋白(West-blot)明胶酶活性分析(Zymography)观察不同浓度的PMA作用于人胃癌BGC823细胞不同时间后的MMP-9表达.结果 PMA浓度1 5mg/L、3 0mg/L、6 0mg/L、12 0mg/L、24 0mg/L 24h时对人胃癌BGC823细胞作用后MMP-9表达率分别为(19 1±1 27)%、(25 3±5 7)%、(52 6±4 8)%、(67 9±3 6)%、(91 3±2 3)%;48h时分别为(21 1±1 9)%、(29 2±3 6)%、(56 6±4 3)%、(76 1±5 1)%、(93 3±2 9)%;72h时分别为(23 4±3 7)%、(37 8±4 2)%、(60 3±14 5)%、(83 6±18 1)%、(95 6±1 3)%.结论 PMA对MMP-9表达的影响浓度剂量和时间依赖性,最佳浓度24 0mg/L,最佳时间24h.     

姜黄素抑制人胃癌BGC-823细胞生长并诱导其凋亡的机制研究

目的:探讨姜黄素抑制人胃癌BGC-823细胞生长并促人胃癌BGC-823细胞凋亡的生物学作用及其调控机制。方法:常规体外培养对数生长期胃癌BGC-823细胞,细胞分为对照组,低、中、高姜黄素处理组四组,姜黄素浓度分别为0mg/L5,mg/L1,0mg/L,20mg/L。姜黄素处理24h后,采用甲基噻唑(MTT)比色法及流式细胞仪测定细胞增殖水平及细胞凋亡率;采用免疫组化法测定细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达;采用PCR检测Caspase-3的mRNA表达水平。结果:MTT检测显示姜黄素能抑制人胃癌BGC-823细胞増殖,呈现浓度依赖性;流式细胞仪显示姜黄素能有效诱导细胞的凋亡,呈现浓度依赖性,其中20mg/L姜黄素处理24h后细胞凋亡率为48.3%;免疫组化试验表明姜黄素处理使人胃癌BGC-823细胞中Bax表达水平上调,同时Bcl-2蛋白表达水平下调;且细胞中Caspase-3的mRNA表达水平受姜黄素诱导而增高。结论:姜黄素对人胃癌BGC-823细胞的增殖具有明显抑制作用,呈浓度依赖性促进细胞凋亡,这种生物学效应可能与激活Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达而活化Caspase-3的信号通路有关。该研究为深入探讨姜黄素诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡的机制提供了重要依据。