EFFECT OF VL AND VH CONSENSUS SEQUENCE-SPECIFIC PRIMERS ON THE BINDING AND EXPRESSION OF A MINI- MOLECULE ANTIBODY DIRECTED TOWARDS HUMAN GASTRIC CANCER

Objective. To construct ScFv and Fab from murine anti-gastric cancer monoclonal antibody(mAb) 3H11.Methods. At first,3H11 ScFv and Fab were constructed with Ⅴ genes PCR amplified by degenerate primers for FR1 .The bacterial expressed 3H11 Ab fragments showed no antigen binding activity.Then,phage antibody library and random mutated library were constructed from 3H11 hybfidoma cells and panning selection was performed. Again the i-dentification of positive clone was failed. Finally the N-terminal sequences of Ⅴ regions were resumed to 3H11 original sequences by site-directed mutagenesis via PCR.Restdts. Binding activity to gastric cancer cells was detected only from N-terminal sequence corrected 3H11 ScFv and Fab, though the expression of the Ab fragments was not affected. Correction of either VL or VH N-terminal se-quences could partially resume the antigen binding activity. Conclusion. Sequence changes of Ⅴ region N terminal introduced by PCR may seriously affect antigen binding without affecting the expression of antibody.     

国产重组酵母乙肝疫苗对成人的免疫效果

目的:了解国产重组酵母乙肝疫苗(YDV)5μg和10μg对成人的安全性和免疫学效果.方法:199例研究对象随机分为2组,分别接受YDV 5μg和10μg,每人每月肌内注射1次,共3次(全程免疫)后1个月,进行免疫效果观察.检测血清乙肝表面抗体阳转率和乙肝表面抗体平均几何滴度(GMT),并观察2组的不良反应.结果:研究对象中未发现中、重度的局部和全身不良反应.接种5μg和10μg疫苗组的乙肝表面抗体阳转率分别为89.25%及98.11%;乙肝表面抗体GMT分别为18.88及54.47mIU·mL-1,2组的GMT差异有显著性(P＜0.05).结论:YDV成人免疫是安全的,10μg YDV抗乙肝表面抗体的GMT明显高于5μg YDV.     

抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选

目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

癌胚抗原单链抗体—链亲和素融合蛋白的功能鉴定

目的：用ｐＥＴ２１原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体－链亲和素融合蛋白。方法：融合表达载体转化大肠杆菌菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）,用１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明,融合蛋白分子质量约５７ｋｕ,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合ＣＥＡ与生物素的双特异性。结论：原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过     

人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达1 刘士辉,王国力,黄君健 等.鼠抗人纤维蛋白抗体 Fv 片段的三维结构模建.军事医学科学院院刊,1997,21(2):1202 王 翔,俞炜源.多菌落分组 P C R 法从高背景中筛选重组子.军事医学科学院院刊,1996;20(4):2333 Kutem ri

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序列设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列,然后在化学合成 １４ 条人源化单链抗体基因片段的基础上,利用二次 Ｐ Ｃ Ｒ 方法构建完整的人源化单链抗体基因,并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上,利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因,并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达。结果：构建并挑选到序列正确的全长人源化单链抗体基因,而且在大肠杆菌中实现了目的基因的高表达。结论：基因的部分化学合成, Ｐ Ｃ Ｒ构建及表达筛选是克隆基因的一种有效方法。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

HIV多抗原位点同源序列合成基因的表达及活性鉴定

目的：在原核表达载体系统中对HIV-1gp41/gp120和HIV-2gp125/gp36外膜蛋白多个抗原位点同源序列合成基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法：人工合成含HIV-1gp41的3个抗原位点、HIV-1gp120的2个抗原位点、HIV-2gp125的3个抗原位点和HIV-2gp36的1个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，用异丙-β-Ｄ-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，采用金属离子亲和层析技术纯化表达蛋白，逐渐降低尿素浓度使目的蛋白复性，免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果：目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见相对分子质量约44 000的蛋白带，与设计相对分子质量相符。免疫印迹、ELISA试验显示pRSETB-env质粒的HIV-1/2表达蛋白与HIV-1及HIV-2患者血清都能较好地结合，与其他患者血清无交叉反应。结论：成功构建了由HIV-1/2外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经纯化后纯度较高,并具有良好特异性和活性。     

Assessment of the level of vaccine-induced anti-HBs antibodies in children with inflammatory systemic connective tissue diseases treated with immunosuppression

Objectives

Protective vaccinations are the most effective method of prevention of type B virus hepatitis. The aim of the study was to determine whether in children receiving immunosuppressive therapy due to inflammatory systemic connective tissue diseases the protective concentration of the anti-HBs antibodies produced after vaccination against type B virus hepatitis in infancy is maintained.

Material and methods

The concentration of anti-HBs antibodies was assessed in the sera of 50 children with inflammatory connective tissue diseases – 37 girls (74%) and 13 boys (26%), aged 1.5–17.5 years – during the immunosuppressive treatment, which lasted at least 6 months. The control group consisted of 50 healthy children – 28 girls (56%) and 22 boys (44%) aged 2–17 years. All children were vaccinated in infancy with Engerix B vaccine according to the 0–1–6 months schedule. The antibody concentration of ≥ 10 mIU/ml in patients is regarded as protective.

Results

No protective antibody concentrations were found in 25 cases (50%) in the group of diseased children and only in 2 children in the control group (4%).

Conclusions

The concentration of vaccine-induced antibodies should be assessed in children with inflammatory systemic connective tissue diseases and, in case of the absence of a protective concentration, revaccination should be started. The use of glucocorticosteroids, synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs is no contraindication to vaccination against hepatitis B.     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）紫外线（UV）-照射致弱尾蚴单链抗体（single chain Fv,ScFv）表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原（Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa）的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率（28.0%）;日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。