牛磺酸对肺动脉平滑肌中活性氧及ERK1/2通路的影响

目的：探讨牛磺酸（Taurine,Tau）对缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）中活性氧（ROS）及ERK1/2通路的影响。方法：原代培养大鼠PASMCs,选用第2-5代用于实验。Tau给药浓度80 mmol·L-1,作用时间24 h。实验分组为：1、常氧组2、常氧＋Tau组3、缺氧组4、缺氧＋Tau组。DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量,Westernblot检测磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达。结果：与常氧组比较,常氧＋Tau组中ROS含量没有显著性变化;缺氧组中ROS显著上升,Tau可逆转缺氧诱导的ROS上升。Tau可以逆转缺氧诱导的ERK1/2磷酸化。结论：Tau可维持正常的PASMCs中ROS水平,并且抑制缺氧诱导的ERK1/2磷酸化。     

钙蛋白酶介导低氧诱导的肺动脉高压肺血管重构

目的：研究钙蛋白酶(calpain)在低氧诱导肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制。方法：SD大鼠随机分为低氧模型组和常氧对照组。插管法测定大鼠右心室收缩压及平均肺动脉压,右心室/(左心室+室间隔)比值评价右心肥厚指数,HE染色检测血管重构情况,分别采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测肺动脉calpain-1,-2和-4 mRNA和蛋白的表达。原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞分为4组：常氧对照组、常氧对照+ MDL28170(calpain抑制剂)组、低氧模型组、低氧模型+MDL28170组。MTS及流式细胞术观察细胞增殖情况,实时荧光定量PCR检测Ki-67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA) mRNA表达情况。结果：与常氧对照组大鼠比较,低氧模型组大鼠右心室收缩压、平均肺动脉压及右心肥厚指数显著增加,肺动脉血管显著重构;同时,低氧模型组大鼠肺动脉中calpain-1,-2,-4 mRNA和蛋白表达也显著上调。与常氧对照组细胞比较,低氧模型组细胞显著增殖,MDL28170可显著抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,同时逆转低氧诱导的Ki-67和PCNA mRNA表达上调。结论：calpain介导低氧诱导的肺动脉高压肺血管重构,其机制可能与介导低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖有关。     

Iptakalim, a novel ATP-sensitive potassium channel opener, inhibits pulmonary arterial smooth muscle cell proliferation by downregulation of PKC-α

Iptakalim is a new ATP-sensitive potassium (K ATP ) channel opener, and it inhibits the proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) and pulmonary vascular remodeling. However, the underlying mechanism remains unclear. In the present study, we found that iptakalim significantly decreased pulmonary artery pressure, inhibited pulmonary ariery remodeling and PKC-α overexpression in chronic hypoxia in a rat pulmonary hypertension model. Iptakalim reduced hypoxia-induced expression of PKC-α, ...     

骨形成蛋白-2对低氧状态下的人肺动脉平滑肌细胞PTEN表达的作用

目的:研究骨形成蛋白-2(BMP-2)对低氧状态下人肺动脉平滑肌细胞(Pu lmonary artery smooth musc le cells,PASMCs)的PTEN(Phosohatase and tensin homolog deleted on chromosom e 10)表达调节作用。方法:将培养的人PASMCSs分为对照组(1%的氧浓度,5%的CO2和94%N2条件下培养)和BMP-2组(另加入BMP-2),培养48 h后通过CyQUANT细胞增殖检测试剂盒测定PASMCs的增殖,定量RT-PCR方法检测PTEN基因表达,W estern b lot方法检测PTEN蛋白的表达。结果:BMP-2组与对照组比较细胞增殖明显降低(P<0.05);定量RT-PCR结果显示,与对照组比较,BMP-2组细胞培养4 h、8 h、24 h后PTEN相对表达量(2-△△ct)均明显升高(P<0.05);进一步的western b lot证实BMP-2组PTEN蛋白表达也明显升高。结论:BMP-2能抑制缺氧状态下的PASMCs的增殖,通过上调PTEN表达可能是其机制之一。     

Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterised by an increase in mean pulmonary arterial pressure which almost invariably leads to right heart failure and premature death. More than 70% of familial PAH and 20% of idiopathic PAH patients carry heterozygous mutations in the bone morphogenetic protein (BMP) type 2 receptor (BMPR2). However, the incomplete penetrance of BMPR2 mutations suggests that other genetic and environmental factors contribute to the disease. In the current study, we investigate the contribution of autophagy in the degradation of BMPR2 in pulmonary vascular cells. We demonstrate that endogenous BMPR2 is degraded through the lysosome in primary human pulmonary artery endothelial (PAECs) and smooth muscle cells (PASMCs): two cell types that play a key role in the pathology of the disease. By means of an elegant HaloTag system, we show that a block in lysosomal degradation leads to increased levels of BMPR2 at the plasma membrane. In addition, pharmacological or genetic manipulations of autophagy allow us to conclude that autophagy activation contributes to BMPR2 degradation. It has to be further investigated whether the role of autophagy in the degradation of BMPR2 is direct or through the modulation of the endocytic pathway. Interestingly, using an iPSC-derived endothelial cell model, our findings indicate that BMPR2 heterozygosity alone is sufficient to cause an increased autophagic flux. Besides BMPR2 heterozygosity, pro-inflammatory cytokines also contribute to an augmented autophagy in lung vascular cells. Furthermore, we demonstrate an increase in microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta (MAP1LC3B) levels in lung sections from PAH induced in rats. Accordingly, pulmonary microvascular endothelial cells (MVECs) from end-stage idiopathic PAH patients present an elevated autophagic flux. Our findings support a model in which an increased autophagic flux in PAH patients contributes to a greater decrease in BMPR2 levels. Altogether, this study sheds light on the basic mechanisms of BMPR2 degradation and highlights a crucial role for autophagy in PAH. © 2019 The Authors. The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of Pathological Society of Great Britain and Ireland.     

牛磺酸抑制缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及信号转导机制

目的：探讨牛磺酸（taurine,Tau）对缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响,并且研究细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路是否参与了Tau抑制PASMCs增殖的过程及可能的分子机制。 方法：原代培养大鼠PASMCs,选用第2~5代用于实验。Tau给药浓度为 80 mmol·L^-1,ERK1/2阻断剂（PD98059）浓度为50 μmol·L^-1,给药时间24 h。①体外噻唑蓝比色法（MTT）、细胞免疫荧光和蛋白免疫印记法检测牛磺酸在不同条件下对大鼠PASMCs增殖能力的影响,将细胞分为4组：常氧组、常氧+Tau组、缺氧组、缺氧+Tau组。②蛋白免疫印记法检测ERK1/2通路是否参与了Tau抑制缺氧诱导PASMCs增殖的进程中。实验分为5组：常氧组、缺氧组、缺氧+Tau组、缺氧+Tau+PD98059组、缺氧+PD98059组。 结果：①缺氧可诱导PASMCs增殖,常氧情况下Tau对PASMCs细胞增殖无影响,常氧及缺氧条件下Tau对PASMCs中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达无影响。Tau可以逆转缺氧诱导的细胞增殖核抗原（PCNA）（P<0.01）、细胞周期蛋白A（Cyclin A）表达上调（P<0.05）。②常氧情况下Tau对磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）的表达没有影响,缺氧使p-ERK1/2的表达上调（P<0.01）,Tau逆转缺氧诱导的p-ERK1/2表达上调（P<0.05）。PD98059与Tau均可抑制缺氧诱导的PCNA,Cyclin A,p-ERK1/2表达上调,与缺氧单独加药Tau或缺氧单独加入PD98059对比,缺氧+Tau+PD98059组PCNA,Cyclin A,p-ERK1/2表达下调更显著。 结论：Tau可抑制缺氧诱导的PASMCs增殖,并且可能是通过ERK1/2通路调控的。     

葛根素对PI3K/AKT通路介导PASMCS凋亡的影响

探讨葛根素(puerarin,Pue)对缺氧抑制的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)凋亡的影响,并研究细胞外信号PI3K/AKT通路是否参与了Pue诱导PASMCs凋亡的过程。以血清饥饿组(SD组)为对照组,通过噻唑蓝比色法(MTT)、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和蛋白免疫印迹法检测Pue对大鼠PASMCs凋亡情况的影响。采用蛋白免疫印记法检测PI3K/AKT通路是否参与了Pue诱导缺氧抑制的PASMCs凋亡的进程中。结果显示,①常氧条件下Pue对PASMCs细胞凋亡无影响,缺氧可抑制PASMCs凋亡,常氧及缺氧条件下Pue对TNF-α表达无影响。Pue可以逆转缺氧诱导的Bcl-2(P<0.01)表达上调以及Bax(P<0.01)表达下调。②常氧情况下Pue对P-AKT的表达没有影响,LY294002与Pue均可抑制缺氧诱导的Bcl-2,P-AKT表达上调以及Bax表达下调,与缺氧单独加Pue或缺氧单独加入LY294002对比,缺氧+Pue+LY294002组Bcl-2,Bax,P-AKT表达变化更显著。结果表明,Pue可诱导缺氧抑制的PASMCs凋亡,并且可能是通过PI3K/AKT通路调控的。     

瞬时受体电位M7通道与血小板源性生长因子和5-HT促进大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖相关性的研究

目的：探讨瞬时受体电位M7通道（transient receptor potential melastatin 7, TRPM7）在血小板源性生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）诱导的肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs）异常增殖中的作用。方法：利用贴块法和酶解法分离大鼠PASMCs。采用RT-PCR、Western blot和全细胞膜片钳技术观察TRPM7在PASMCs中的功能性表达。利用TRPM7阻断剂2-APB,采用MTT的方法检测TRPM7对PDGF和5-HT诱导的PASMCs异常增殖的作用。结果：RT-PCR、Western blot结果显示,TRPM7在大鼠PASMCs中有mRNA和蛋白表达。利用膜片钳技术检测到TRPM7电流,且PDGF可上调TRPM7内、外向电流。100 μmol•L^-1 2-APB可抑制PDGF和5-HT引起的大鼠PASMCs异常增殖。结论：TRPM7可能参与PDGF和5-HT诱导的大鼠PASMCs的增殖,有可能成为肺动脉高压临床治疗新的靶点。     

间尼索地平对5-羟色胺诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中Ca2+/CaM/CaN通路的影响

探讨Ca²⁺/CaM/CaN信号通路在5-羟色胺 (5-HT) 诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs) 增殖中的作用以及间尼索地平 (m-Nis) 对此的影响。采用细胞培养、噻唑蓝 (MTT) 比色检测、激光共聚焦显微镜及反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 等方法, 研究5-HT (1 μmol·L⁻¹) 对大鼠PASMCs细胞增殖的影响以及m-Nis对此的抑制作用, 并通过检测m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖中Ca²⁺/CaM/CaN通路的影响深入探讨其作用机制。结果显示, 5-HT (1 μmol·L⁻¹) 可明显诱导大鼠PASMCs增殖 (P < 0.01), m-Nis对此有明显的抑制作用, 并呈现一定的浓度依赖性 (P < 0.05或P < 0.01); 另外, m-Nis还明显抑制了5-HT引起的[Ca²⁺]_i的升高 (P < 0.01)、CaM和CaN mRNA的表达以及CaN活性的升高 (P < 0.05或P < 0.01)。结果表明, Ca²⁺/CaM/CaN信号通路在5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖中起重要作用, m-Nis抗5-HT诱导的增殖作用可能与抑制[Ca²⁺]_i增高从而阻断了Ca²⁺/CaM/CaN信号通路有关。     

间尼索地平对5-羟色胺诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的探讨间尼索地平(m-Nis)对5-羟色胺(5-HT)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖和迁移的影响,并深入研究其作用机制。方法采用植块法培养大鼠PASMCs。实验分为6组:空白对照组、5-HT(1μmol·L-1)组,m-Nis(10-5、10-6、10-7、10-8mol.L-1)组。噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell迁移小室法分别测定PASMCs的增殖和迁移,Western blot法检测大鼠PASMCs中增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达及细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)的磷酸化水平,研究m-Nis对ERK1/2/MAPK信号通路的影响。结果不同浓度m-Nis明显抑制了5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖(P<0.05或P<0.01)和迁移(P<0.01),并呈现一定的浓度依赖性;另外,Western blot结果显示m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs中PCNA的蛋白表达有不同程度的抑制作用(P<0.05或P<0.01),10-5,10-6,10-7mol.L-1m-Nis还明显抑制了5-HT诱导的大鼠PASMCs中ERK1/2磷酸化水平的升高,p-ERK1/2/ERK1/2比值均有不同程度地降低(P<0.05或P<0.01)。结论m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移有明显的抑制作用,可能与其抑制PCNA蛋白表达及ERK1/2/MAPK信号通路有关。