体外呼吸道上皮细胞细菌黏附模型的建立

目的 基于流动小室的构架,建立一种用以研究细菌在呼吸道上皮细胞黏附的体外模型.方法 以2 mg/mL牛胶原蛋白预包被流动小室后,接种1 × 105个HBE细胞,含20％ 血清的RPMI1640培养基,37 ℃,5 ％CO2孵箱培养24 h铺满底部后用于实验;以流动小室中细胞数量为评价指标,正交设计考察流速、流动时长和流动相成分对细胞模型的影响,筛选最优实验条件;以正交实验结果 为条件,细菌黏附量为指标,与常规用于细菌细胞黏附的培养板方法 相比较,分别于2 × 108、108、5 ×107、2.5 × 107CFU/mL接种浓度下与细胞进行黏附实验,判定流动小室是否为细菌细胞黏附研究的可靠模型;以SYTO9荧光标记细菌的方法 表征黏附于细胞的细菌量.结果 优化得到最佳实验条件,影响因素主次为流速＞ 流动时长＞ 流动相组成,方差分析结果 显示,流速和流动时长影响因素有显著差异(P＜ 0.05) ,流动相组成无显著差异(P＞ 0.05) .荧光染色后,该模型可实现细菌在呼吸道上皮细胞上黏附的荧光实时观察;细菌黏附的定量结果 显示,随着感染复数增大,流动小室模型与常规培养板方法均检测出黏附细菌的增多,且呈线性关系;但同一感染复数下常规培养板方法 所检测出的黏附菌量与流动小室模型相比显著增多(P＜ 0.05) .结论 在适宜的流速、流动时长下,该模型可用于研究细菌在呼吸道上皮细胞上黏附,并且较常规培养板方法 具有更贴近体内环境、准确度高、可实时观察等优点.     

嗅鞘细胞微环境和水凝胶生物支架对脂肪干细胞成嗅鞘样细胞分化的影响

目的 比较研究脂肪干细胞和嗅鞘细胞以两种不同方式共培养后脂肪干细胞P75的阳性表达.方法 以Transwell小室为共培养载体.无支架共培养组以脂肪干细胞接种于上室,嗅鞘细胞接种于下室,支架共培养组以脂肪干细胞联合水凝胶生物支架(BDTM PuraMatrixTM Peptide Hydrogel)接种于上室,嗅鞘细胞接种于下室.检测两组细胞共培养12 d后其脂肪干细胞P75的表达.结果 共培养12 d后无支架共培养组和支架共培养组都有部分细胞表达P75,且支架共培养组表达率更高.结论 脂肪干细胞在嗅鞘细胞生长微环境中能向嗅鞘样细胞分化.     

Matrigel穿膜侵袭实验技术改进

侵袭和转移是恶性肿瘤最显的特征,Matrigel穿膜侵袭实验是研究肿瘤细胞在体外侵袭能力的常用实验之一,经常使用Boyden小室体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭潜能。但是在实验中常常并不能获得理想的结果,其原因是没有掌握实验的具体操作细节。我们经过反复的实践,通过技术改进,取得了较好的效果。     

基质细胞衍生因子-1诱导神经干细胞靶向性迁移的实验研究

目的 观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对神经干细胞(NSCs)迁移的影响.方法 由胚胎大鼠脑组织获取NSCs并进行传代培养和分化鉴定,使用流式细胞术检测NSCs纯度及SDF-1特异性受体CXCR4的表达情况,之后利用Blind-Well小室体外迁移体系观察不同浓度的SDF-1(0 ng/L、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL)对NSCs迁移数量的影响,并使用μ-载片观察SDF-1对NSCs迁移距离的影响.结果成功分离培养得到了能够在体外不断分裂增殖、具有多向分化潜能的NSCs,连续传3代后绝大部分细胞nestin表达阳性,nestin和CXCR4的共表达率达到80%左右.细胞趋化实验结果表明,SDF-1对NSCs有较强的趋化作用,随着SDF-1浓度的升高,发生迁移的细胞数量也随之增加,并于SDF-1浓度为500ng/mL时达到最高峰[(256.79±38.27)个细胞/每高倍视野].在μ-载片细胞生长通道两侧的SDF-1浓度梯度(500ng/mL→0ng/mL)作用下,由细胞克隆球迁出的细胞呈不对称分布,通常有更多的迁出细胞分布于趋化因子浓度较高的一侧,且该侧细胞的最大迁移距离也比对侧远.结论 SDF-1与其特异性受体CXCR4相巨作用能够诱导NSCs发生靶向性迁移.     

外周血单个核细胞介导乙型肝炎病毒感染的transwell 小室体外模型研究

目的：观察感染 HBV 的 PBMC 经人绒毛膜癌滋养层细胞（Bewo 细胞）构建的胎盘屏障迁移情况,探讨 PBMC 作为载体转运 HBV 的生物学作用。方法培养并用细胞计数试剂盒-8检测培养 Bewo 细胞和 PBMC 的增殖和活性。用 HBV DNA 含量为5×106拷贝／mL 的乙型肝炎患者血清100μL 感染 PBMC 后,用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染料标记感染的细胞, transwell 小室建立 Bewo 细胞和感染 HBV 的 PBMC 共培养模型。用流式细胞仪检测感染 HBV 的PBMC 迁移情况,荧光定量 PCR 法检测 transwell 下室中 PBMC HBV DNA 含量。结果 PBMC、Bewo细胞均在接种24 h 左右开始增殖,120 h 左右开始进入生长停滞期。transwell 小室共培养0、12、24和48 h,下室中绿色荧光标记的 PBMC 量分别为（0．445±0．021）％、（21．180±4．653）％、（34．830±7．156）％和（64．185±3．161）％,随着培养时间的延长,下室中检测到的标有绿色荧光的 PBMC 量越多（F ＝68．983,P ＝0．001）。共培养24、48 h 时,下室 PBMC HBV DNA 分别为（1．925±0．431）×103、（2．565±0．361）×103拷贝／mL,即下室中的 PBMC 发生感染。结论 PBMC可以作为 HBV 肝外感染的靶细胞,利用 transwell 小室构建胎盘滋养层屏障可以为体外研究 HBV 跨胎盘传播提供新思路。     

Transwell侵袭小室技术的改良及其在人骨髓间充质干细胞诱导分化中的应用

目的：分离、培养和鉴定人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），应用改良的Transwell侵袭小室技术，探讨血管内皮生长因子（VEGF）及内皮细胞条件诱导液对其体外诱导分化中的作用。方法：采用Percoll（1．073g／ml）分离液分离骨髓单个核细胞，体外培养MSCs，流式细胞术分析鉴定MSCs的纯度，Transwell侵袭小室技术结合LSCM，实时监测MSCs在Matrigel与VEGF／内皮细胞条件诱导液构成的内皮细胞生长微环境中的运动迁移情况。结果：经Percoll分离、体外培养扩增的MSCs，细胞纯度可达95％左右；VEGF组迁移的深度虽高于对照组（P〈0．05），但迁移至聚碳酸脂膜下的细胞与对照组相比，并无统计学意义（P〉0．05）。内皮细胞条件诱导液促进MSCs的迁移，在Matrigel内迁移的深度及迁移至聚碳酸脂膜下的细胞均明显多于对照组（P〈0．05）。结论：共聚焦激光扫描显微术与Transwell侵袭小室技术的结合，能够从时间和空间上对后者进行观察，使该实验得到改良；利用内皮细胞条件诱导液与Matrigel模拟体外内皮细胞生长的微环境，并从空间上观测了MSCs穿越人工基底膜的情况，为MSCs向内皮细胞体外诱导开辟了新的思路。     

Transwell小室环境下小鼠不同器官微环境对人舌癌细胞生长的影响

目的：探讨骨髓和淋巴结微环境对人舌癌细胞SCC-9生长的影响。方法：利用Transwell小室建立微环境与SCC-9共培养体外模型,分为5组：SCC-9单独培养组（对照组）,SCC-9+Balb/c小鼠骨髓共培养组,SCC-9+Balb/c小鼠淋巴结共培养组,SCC-9+Balb/c裸鼠骨髓共培养组,SCC－9+Balb/c裸鼠淋巴结共培养组。采用直接计数法分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h检测SCC-9的数量。结果：利用Transwell小室成功构建骨髓、淋巴结微环境与SCC-9共培养体外模型。计数结果显示,SCC-9在Balb/c裸鼠淋巴结共培养组中的增殖程度高于其他4组（P<0.05）;在Balb/c裸鼠骨髓,Balb/c小鼠骨髓和淋巴结共培养组中均低于对照组（P<0.05）,且抑制程度无明显差异（P>0.05）。结论：不同微环境可能通过不同的肿瘤休眠机制,控制肿瘤细胞的增殖与休眠,最终被动形成淋巴转移的靶向性。     

Transwell小室共培养条件下RPE促进Müiler细胞的增殖和迁移

目的：观察在体外共培养系统中RPE对Müiler细胞的影响。方法：Transwell小室共培养RPE和Müiler细胞，MTT法、细胞计数法，测定Müiler增殖和迁移的情况。结果：Müiler细胞增殖的实验：Müiler细胞的增殖。除了3h与6h，24h与48h之外，在其他各时间点之间差别有统计学意义。Müiler细胞与RPE共培养组和Müiler细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。Müiler细胞迁移的实验；Müiler细胞迁移，除了3h和6h之外，在其他各时间点之间差别有统计学意义。Müiler细胞与RPE共培养组和Müiler细胞单独培养组两组之间差别有统计学意义。在析因设计实验中，与RPE共培养、缺氧条件，这两个因素都可以分别作为独立的因素促进Müiler细胞的增殖和迁移，而两者不存在协同作用。结论：正常和缺氧条件下RPE促进Müiler的增殖、迁移，随共培养时间的延长RPE促进Müiler增殖、迁移的作用加强。缺氧条件下RPE与Müiler细胞间的相互作用在视网膜增殖性疾病中起到了重要的作用。     

多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子对血管新生作用的研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)细胞脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平及其与MM细胞诱导的血管新生的关系。方法采用RT-PCR法、Western blot法及ELISA法检测MM细胞系KM3、RPMI8226细胞BDNF的表达及分泌。采用MTT法观察MM细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用;用改良的Boyden小室法观察MM细胞培养上清液对HUVEC迁移的影响;采用体外小管形成实验,观察MM细胞培养上清液对HUVEC分化的影响。结果KM3、RPMI8226细胞不仅表达BDNF mRNA,也表达和分泌BDNF蛋白,BDNF的基础分泌水平在其生物学作用范围内。KM3、RPMI8226细胞培养上清液均可明显促进HUVEC增殖,含50.0%KM3细胞培养上清液组和完全KM3细胞培养上清液组HUVEC数分别为对照组的(1.85±0.23)倍和(2.16±0.29)倍(P<0.05),抗人类BDNF中和抗体可部分抑制其促增殖活性;含50.0%KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为1.85±0.23,完全KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为2.16±0.29,与对照组比较,差异有统计学意义(P值均<0.05),并可明显促进基质胶中网状毛细血管形成(P<0.01),抗BDNF中和抗体可明显抑制其作用。结论MM细胞表达和分泌BDNF,BDNF可能参与MM细胞诱导的血管新生。     

超声空化效应对肿瘤细胞迁移运动影响的实验研究

目的 探讨高机械指数的超声造影空化效应对肿瘤细胞迁移运动的影响.方法 体外培养结肠癌细胞株(Lovo细胞).分为对照组、微泡 超声组、单纯超声辐照组和单纯微泡组.使用超声造影剂SonoVue,超声探头频率1.5MHz,机械指数1.7进行超声间歇辐照,采用Millicell-PCF培养小室法,观察超声造影空化效应对肿瘤细胞迁移运动的影响.结果 对照组、单纯辐照组及单纯微泡组之间的迁移能力无明显差异(P>0.05),而微泡 超声组与对照组之间比较,肿瘤细胞的迁移能力明显低于对照组(P<0.01).结论 高机械指数超声造影增强超声的空化效应,对肿瘤细胞的迁移能力有明显抑制作用.