9 Survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞的抑制作用

目的:探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌细胞HepG2的抑制作用。方法:采用免疫组织化学法检测肝细胞癌（HCC）组织中survivin的表达。采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2，Western blot检测细胞survivin蛋白的表达，FCM检测细胞的凋亡率，观察细胞在软琼脂中的集落形成能力。建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察survivin ASODN的体内抑癌作用。 结果:（1）肝癌组织中survivin表达阳性率为75.8％(25/33)，明显高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01);（2）survivin ASODN体外转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达，ASODN组HepG2细胞凋亡率明显高于空白对照组和SODN组(P<0.01)，ASODN组HepG2细胞在软琼脂中形成的集落数目明显少于空白对照组和SODN组(P<0.01);（3）ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(P<0.01)，ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(P<0.05)。结论:Survivin在HCC组织中高表达;survivin ASODN可以诱导HepG2细胞凋亡，在体外实验和动物实验中对HepG2细胞生长都有抑制作用。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠体内肝靶向反义RNA抗病毒疗效研究

目的：探讨半乳糖修饰的反义RNA真核表达质粒在乙型肝炎病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。方法：以半乳糖多聚赖氨酸（Gal-PLL)作肝靶向载体，将乙型肝炎病毒基因C区的反义RNA真核表达重组质粒（pCEP4-aC）制备为Gal-PLL－pCEP4-aC。将24只血清HBV DNA、HBsAg阳性的小鼠，随机等分为Gal-PLL－pCEP4-aC治疗组、Gal-PLL-pCEP4对照组和生理盐水阴性对照组，于实验第1天尾静脉分别注射Gal-PLL－pCEP4-aC、Gal-PLL－pCEP4（100μg/只）和等体积的生理盐水，观察治疗前后血清HBV DNA以及HBsAg变化。结果：Gal-PLL－pCEP4-aC治疗组21天时血清HBV－DNA转阴率62．5％（5／8），且7，14，21天时血清HBsAg明显降低；而Gal-PLL－pCEP4组血清HBV DNA转阴1只（1／8），生理盐水组8只均未转阴，两组用药后血清中HBsAg与用药前比较差异性均不明显（P＞0．05）。结论：肝靶向反义RNA能在乙肝基因小鼠体内抑制HBV的复制和抗原表达。     

CpG ODN增强乙肝疫苗在老年小鼠中的免疫应答

目的：探讨CpG ODN对老年小鼠的体液和细胞免疫应答的增强作用。方法：选用老年C57BL／6小鼠，将乙肝疫苗和10μg、20μg CpG ODN同时或单独肌注到小鼠体内，两周后以同样剂量加强免疫一次，再过3周后摘除眼球取血，用EILSA方法检测抗HBs16；抗体和IL-12；无菌取脾脏作HE染色，观察脾脏淋巴细胞变化。结果：10μg和20μg CpG ODN与疫苗同时注射组产生的抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的3倍和4倍；产生的IL-12水平较对照组有明显升高，且20μg比10μCpG组产生的IL-12水平更高。光镜下各组的脾脏淋巴细胞的变化如下：正常老年鼠组脾脏淋巴细胞较正常青年鼠组明显稀少；老年鼠 10μgCpG组脾脏淋巴细胞较正常老年鼠组有了明显增加，且细胞核也明显增大；20μgCpG组增加的更加明显。结论：CpG ODN能增强乙肝疫苗在老年小鼠中的体液和细胞免疫应答。     

反义骨调素寡核苷酸对肾小管上皮细胞骨调素mRNA表达及其胶原凝胶黏附能力的影响

【目的】观察反义骨调素(OPN)寡核苷酸(AS-ODN)对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)骨调素mRNA表达及黏附能力的影响;比较AS-ODN的游离形式和经阳离子脂质体(DOTAP)包裹形式的反义抑制效果。【方法】用荧光显微镜观察荧光素标记的AS-ODN在细胞中的分布;将寡核苷酸处理NRK52E细胞48h,用TRIzol试剂提取细胞总RNA;用RNA斑点杂交和RT-PCR检测OPNmRNA的表达;将ODN/DOTAP复合物处理的细胞置于胶原凝胶表面,计算细胞的黏附率。【结果】AS-ODN能转移进入胞核中;AS-ODN处理的细胞OPNmRNA表达水平均较低(P<0.05),而顺义或错义寡核苷酸处理的细胞OPNmRNA水平较高,即使30μmol/L浓度也无抑制作用;游离AS-ODN最低抑制浓度为3.75μmol/L,而AS-ODN浓度为0.5μmol/L的AS-ODN/DOTAP复合物具有良好抑制作用;AS-ODN处理的细胞黏附率降低,而顺义或错义寡核苷酸处理的细胞黏附能力较强。【结论】反义骨调素寡核苷酸能特异地抑制大鼠肾小管上皮细胞OPNmRNA表达和黏附胶原凝胶能力;阳离子脂质体能促进AS-ODN的反义抑制作用。     

c-myc反义寡核苷酸对肿瘤细胞表面抗原和对CD3AK杀伤敏感性的调节作用

目的：观察c-myc反义寡核苷酸上调人高转移性肺巨细胞腺癌PG细胞表面抗原分子的表达水平，提高免疫效应细胞杀伤敏感性的作用和机制。方法：PT－PCR方法检测c-myc mRNA表达水平的变化。MTT法检测细胞增殖活性和CD3AK杀伤活性的变化。流式细胞术检测细胞表面抗原表达的变化以及c-myc蛋白表达水平的变化。结果：c-myc反义寡核苷酸（1μmol/L）明显地抑制PG细胞c-myc mRNA和蛋白表达水平，显著提高细胞表面HLA－ABC、ICAM－1分子的表达，其表达率分别从68．44％、38．40％增高到83．16％和42．09％（P＜0．01）。CD3AK对反义寡核苷酸处理的PG细胞的不同效靶比杀伤活性，分别从40．0％、65．0％、74．0％增高到52．0％、74．0％、91．0％（P＜0．01）。结论：c-myc反义寡核苷酸通过抑制PG细胞c-myc mRNA和蛋白表达，上调PG细胞表面HLA－ABC、ICAM－1分子的表达水平，提高其对免疫效应细胞的杀伤敏感性。     

α2，6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的 研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2，6唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响．方法 结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6GalⅠcDNA或反义ST6GalⅠcDNA的部分序列的表达载体pcDNA3.1，以RT—PCR检测转染子ST6GalⅠmRNA的表达．流式细胞仪检测细胞表面α2，6唾液酸含量．结果 转染正义ST6GalⅠcDNA的克隆显示ST6GalⅠmRNA的表达增强以及接骨木凝集素(SNA)与细胞表面成分的结合增加；而转染反义ST6GalⅠcDNA的部分序列的细胞克隆的ST6GalⅠmRNA的表达减少．SNA与细咆表面成分的结合力降低．结论 ST6GalⅠ的表达直接影响细胞表面α2．6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能利用反义核酸技术抑制ST6GalⅠ的表达并降低肿瘤细咆表面α2，6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段．     

Antisense oligonucleotides and short interfering RNAs silencing the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 improve proliferation of Duchenne muscular dystrophy patients’ primary skeletal myoblasts

Increased levels of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 associated with decreased myoblast proliferation may be involved in the dystrophic process in Duchenne muscular dystrophy (DMD). Therefore we are interested to improve the proliferation of primary myoblasts of DMD patients by a reduction in p21 using either antisense oligonucleotides (ASO) or short interfering RNAs (siRNA). After transient transfection of myoblasts in cell culture proliferation was analyzed using a 5-bromo-2-deoxyuridine assay comparing specific transfected cells with untransfected cells and cells transfected with scrambled ASO and luciferase siRNA, respectively. Four of five Dystrophin-deficient (Dys^–) cell culture samples revealed an increase in proliferation between 7% and 18% compared to untransfected cells and between 8% and 36% compared to cells transfected with scrambled ASO. Transfection with siRNA was performed for selected samples to determine whether siRNA is more effective in gene silencing than ASO. The increase in proliferation using luciferase siRNA as reference was comparable to or less than ASO data using scrambled ASO as reference. Using untransfected cells as reference, the increase in proliferation was higher for siRNA than ASO (20–47% vs. 7–18%), but the data must be carefully interpreted with respect to nonspecific effects on gene expression by siRNA. Our findings of transient p21 gene silencing represent a basis for viral vector-mediated drug-inducible p21 shRNA expression in Dys^– myoblasts which might enhance, prolong and regulate the proliferation effect.S. Endesfelder and A. Kliche contributed equally to this work     

Human immunodeficiency virus type 1 Tat protein induces an intracellular calcium increase in human monocytes that requires DHP receptors: involvement in TNF-alpha production

HIV-1 Tat protein, acting at the cell membrane, stimulates the production by human monocytes of TNF-α, a cytokine implicated in both HIV-1 replication and pathogenesis. Here, we analyze, in primary human monocytes, the mechanisms involved in Tat-stimulated calcium mobilization and its relationship with TNF-α production. We show that the Tat protein induces a calcium signal by mobilizing calcium from extracellular stores. This calcium signal is totally blocked when cells are stimulated in the presence of DHP receptor inhibitors such as nimodipine or calcicludine, thus suggesting the implication of this L-type calcium channel. By using RT-PCR amplification, Western blot with antibodies directed against the α1D subunit, binding assays with specific agonists or antagonists, and inhibition with specific antisense oligonucleotides, we show that DHP receptors are expressed and functional in primary human monocytes. Interestingly, we demonstrate that Tat-induced calcium mobilization is tightly linked to TNF-α production, thus indicating that Tat-induced mobilization and TNF-α production are entirely mediated by DHP receptors, as shown by their total inhibition by nimodipine, calcicludine, or anti-α1D antisense oligonucleotides.     

Survivin反义核酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一个成员，具有强大的抗细胞凋亡功能，在几乎所有肿瘤组织中特异性表达，而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达。本研究针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸，RT—PCR检测表明，该序列反义寡核苷酸可明显降低细胞中survivin基因的mRNA含量；Western印迹显示Survivin蛋白水平也被降低。MTT比色实验法检测结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制SMMC-7721细胞增殖，抑制率为43％，远高于无义寡核苷酸组和空白对照组。反义寡核苷酸还显著增强SMMC-7721细胞对于抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性，TUNEL法检测结果显示，在较低高三尖杉酯碱浓度下，反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组。本研究结果提示，survivin表达的靶向抑制有望应用于肿瘤的辅助治疗之中。     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗