应用白喉毒素-IL-2融合蛋白研究Q126D突变对IL-2功能的影响

IL 2是一非常重要的由 133个氨基酸组成的TH1细胞因子 ,从N端到C端依次为上、上后再下、下的 4个螺旋结构。位于C端的最后一个螺旋结构在其与相应受体的 β、γ亚基的结合中起重要作用。本文应用位点定向突变技术(Site directedmutagenesis)改造了位于第 4个螺旋结构中的第 12 6个氨基酸 ,使其由谷氨酰胺突变为天冬氨酸 ,并分别与白喉毒素 (DT)及其突变体组成融合蛋白 ,并以DT作指示系统 ,观察了这种改变对IL 2与受体结合及其功能的影响。首先将CRM 197(白喉毒素G5 2E突变株 )克隆入PSM30 8的EcoRⅠ与HindⅢ位点间 ,设计 1对分别…     

内质网——肿瘤治疗的新靶点

白喉毒素(DT)是由白喉棒状杆菌所产生的分子量为58kD的外毒素,它在胰蛋白酶的作用下可降解为A和B两个片段,B片段能与敏感宿主细胞的特异受体结合并能将A片段转位到胞浆,A片段具有核糖体依赖的酶活性,它通过灭活真核细胞的肽链延长因子Ⅱ来阻断细胞蛋白合成。     

EWS-FLI 1介导DTA基因在尤文肉瘤移植瘤裸鼠模型体内特异表达研究

目的观察EWS-FLI1介导的白喉毒素A链基因(diphtheria toxin A chain gene,DTA)在尤文肉瘤裸鼠移植瘤模型体内特异表达情况.方法采用尾静脉注射给药,将含有EWS-FLI1特异结合序列ACCGGAAGT和白喉毒素A链基因的真核表达载体pS2-DTA导入尤文肉瘤裸鼠移植瘤模型体内,通过免疫组化及RT-PCR检测DTA的表达情况.结果DTA在肿瘤组织中有高表达,肝组织中有弱表达,心肌组织中表达结果为阴性.结论EWS-FLI1介导的DTA可在尤文肉瘤裸鼠移植瘤内特异表达.     

靶向DF3的白喉毒素A链基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的探讨白喉毒素A链(DTA)基因在DF3/MUC1启动子调控下的杀伤作用。方法构建含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A链基因的表达载体pGL3-DF3-DTA,转染DF3阳性的乳癌细胞MCF-7,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DTA基因的表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长活性;免疫组织化学法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果酶切和测序表明获得了与预期结果相一致的pGL3-DF3-DTA真核表达载体。转染MCF-7细胞后,RT-PCR检测到了249 bp的DTA mRNA片段。与对照组比较,转染pGL3-DF3-DTA的MCF-7细胞生长受到了抑制,流式细胞术检测到的凋亡率达39.43%,而对照组仅有0.28%。结论pGL3-DF3-DTA可对DF3阳性的乳癌细胞产生特异性的杀伤,对乳腺癌的基因治疗有潜在的应用价值。     

Cell-specific expression of the diphtheria toxin A-chain coding sequence induces cancer cell suicide

Objective To test whether the diphtheria toxin A (DT-A) chain coding sequence linked to murine immunoglobulin κ-light chain (Ig κ) promoter and enhancer have selective cytocidal effects on Ig κ producing cells.Methods The diphtheria toxin A gene or β-galactosidase (β-gal) gene were linked to a murine Ig κ promoter and enhancer to construct pcDNA3Ig κDTA or pcDNA3Ig κLacZ plasmids.These plasmids were transfected into Ig κ producing or non-producing cells by the liposome-coated DNA method.Expression of β-gal activity and effects on cell growth of transfected cells were assessed.Results The β-gal gene, under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter, can express in all cell lines.Expression of β-gal under the control of the Ig κ promoter was detected only in the Ig κ producing cell line, CA46.Expression of β-gal was greatly suppressed when cotransfected with pcDNA3Ig κDTA in CA46 cells.Cell growth of CA46 cells transfected with pcDNA3Ig κDTA plasmid was significantly inhibited compared with CA46 cells transfected with pcDNA3Ig κLacZ.Conclusion Selective killing of Ig κ producing cells can be attained by introducing the diphtheria toxin A gene under the control of Ig κ promoter and enhancer.     

携带DT_(390)-VEGF_(165)或DT_(390)-VEGF_(exon7)融合基因的真核表达载体的构建及表达

抑制血管再生可能是治疗实体瘤的有效途径。肿瘤血管生成的主要调控者是血管内皮细胞生长因子(ＶＥＧＦ)。ＶＥＧＦ的 5种异构体中ＶＥＧＦ165是表达丰度最高的异构体 ,ＫＤＲ和Ｆｌｔ 1为ＶＥＧＦ的高亲和受体。1996年Ｓｏｋｅｒ等在各种肿瘤细胞系上发现了仅与ＶＥＧＦ165外显子 7编码的结构域结合的受体 ,即ＶＥＧＦ165Ｒ[1] 。目前将细菌毒素的跨膜结构域和酶性结构域与细胞因子或抗体构成的融合蛋白靶向杀伤各型细胞的研究已有大量报道 ,但这些融合毒素仅对某些类型的肿瘤有效。为扩大癌症治疗范围 ,我们选择ＶＥＧＦ165和ＶＥＧＦｅｘ…     

四环素tet-off系统调控的DT/VEGF融合基因对肝细胞癌的杀伤效应

目的 研究四环素tet-off调控系统对DT390-VEGF165及DT390-VEGFexon7融合基因的调控作用,探索毒素融合基因在调控状态下治疗肝癌的有效途径.方法 构建四环素tet-off调控的DT390一VEGF165或DT390-VEGFexon7融合基因真核表达载体,用脂质体介导转染肝细胞癌HepG2,在四环素有或无的情况下观察肝癌细胞的形态变化,用质粒直接注射法观察构建物对荷肝癌裸鼠的治疗效果.结果 3μg真核表达构建物转染5×105个肝癌细胞/孔(24孔板)96 h后发现,无四环素时转毒素融合基因的细胞存活率为20%,对照细胞存活率为77%;四环素存在时转毒素融合基因的细胞存活率为68%,对照细胞存活率为74%;转染细胞在四环素有或无的情况下经免疫荧光抗体染色均呈现黄绿色荧光,表明融合基因在细胞中得到了表达,且四环素调控系统存在基础量的漏表达;用质粒直接注射瘤体虽可观察到质粒被吸收和表达,但由于表达效率低下,没有明显的治疗效果.结论 四环素调控系统基本上可以控制毒素基因在肝癌细胞中的表达.     

G17-白喉毒素嵌合蛋白的表达、纯化和免疫原性初步研究

目的  构建胃泌素多肽G17-白喉毒素A亚单位（diphtheria toxin subunit A,DTA）嵌合蛋白,并初步研究其免疫原性。方法  用酶切法将编码G17的基因与DTA基因连接后,插入载体pET11C,并在大肠埃希菌BL21中表达。先后用阴离子交换色谱法和分子排阻色谱法对表达的目的蛋白进行纯化。用纯化的G17-DTA免疫NIH小鼠,并用ELISA检测小鼠抗G17抗体。结果  构建的G17-DTA嵌合蛋白可在大肠埃希菌中高效表达,表达量达0.5~0.6 mg/ml菌液。经2次纯化后,G17-DTA的纯度可达95%。纯化的G17-DTA在小鼠中诱生了抗G17抗体。结论  构建的G17-DTA嵌合蛋白能在大肠埃希菌中表达,而且在小鼠中具有免疫原性。     

白喉毒素氨基端389个氨基酸-人碱性成纤维细胞生长因子靶向毒素的克隆表达及对人晶状体上皮细胞毒性研究

目的 为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法 提取灭活的白喉杆菌DNA和12周胎脑皮质RNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端389个氨基酸(DT389)的基因片段及编码18kd人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化鉴定表达产物,噻唑蓝(MTT)试验检测其对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)的毒性作用,流式细胞术鉴定不同剂量融合毒素所致HLECs成活率及细胞死亡形式.结果 扩增得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达;表达的融合蛋白对HLECs有明显的毒性作用并在一定范围内呈明显剂量依赖性,半数致死量为3.8×10-11mol/L,所致细胞死亡方式主要以凋亡为主.结论 DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物促晶状体上皮细胞的凋亡、抑制后发障的研究奠定了物质基础.     

四环素调控白喉毒素基因的重组逆转录病毒载体的构建

将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基化,使肽链延长因子Ⅱ失活,从而抑制宿主细胞蛋白合成[2].Gossen等[3]提出了可调控型高表达系统(Tet系统),这为毒素基因治疗肿瘤开辟了新途径.Tet系统可分为 Tet-On和Tet-Off系统,前者的基因表达是在四环素加入后激活,而后者则是在四环素浓度逐渐降低的情况下激活.我们构建携带四环素系统调控的DTA基因的逆转录病毒载体,为进一步探讨肺癌的基因治疗奠定基础.