低氧适应的进化

氧是生命过程赖以维持的中心支点。光合成的进化使地球大气层由氧构成。进化设计的焦点在于参与代谢过程的调节与开拓氧分子的多功能性。氧接受电子的能力,使其能参与有机物燃烧所需的氧化还原反应,从而获得代谢能。同等重要的还有防御有机体免受活性氧化物(如过氧化氢)损害的进化。为在氧缺乏和氧毒性之间建立1条安全的通道,有机体细胞需要有对胞内氧分压作出适宜反应的遗传程序。     

原核细胞阳性克隆的筛选

基因重组的连接反应物通过转化产生大量转化菌 ,只有通过高敏感和高特异的筛选方法才能挑选和鉴定出含有正确目的基因的重组体。此类方法的基本原理基于 :① 196 7年 ,Ullmann等发现大肠杆菌带有完整的近操纵基因区段 β D半乳糖甘酶阴性的突变体和LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体之间互补 ,实现对 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖(X gal)分解显色形成蓝色菌落 ;② 1975年 ,Grun stein和Hogness介绍一种在硝酸纤维素膜上原位裂解细菌菌落并释放DNA非共价结合于滤膜的方法 ,结合于滤膜的DNA可与相应的放射性标记的核酸探针进行杂…     

Expression and Purification of the Major Outer Membrane Protein of Chlamydia Trachomatis in Prokaryotic Cell

Chlamydiatrachomatis(C.trachomatis)isanobligate intracellularbacterialpathogen.Ocularinfectionwith C.trachomatisserovarsA,B,BaandCleadstotracho ma,aleadingcauseofpreventableblindnessinmanyde velopingcountries[1].Urogenital tractinfectionwithC. trachomat…     

5种食源性致病微生物毒力基因重组质粒的构建、克隆表达与表达产物的研究

目的构建大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌5种主要食源性致病微生物毒力基因重组质粒载体并鉴定其表达产物,为探讨高通量磁性荧光纳米颗粒标记相应的抗体技术快速检测带毒力基因的致病微生物的可行性奠定基础。方法分别从5种食源性致病微生物毒力岛中选择特异性的毒力基因进行引物设计,分别提取5种目的细菌DNA片段,经PCR扩增、电泳回收目的基因片段,将目的基因片段与原核表达载体pET-23a、pET-28a、pET-32a构建各自的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒载体,构建后的重组质粒进行酶切和测序鉴定,再转化入表达宿主E·coliBL21（DE3）。在0.1 mmol/L的IPTG诱导下,目的质粒载体在E·coliBL21（DE3）株中表达,SDS-PAGE电泳检测表达蛋白。结果实验成功构建大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌等细菌的毒力基因重组质粒载体pET-23a-eaeA、pET-28a-tdh、pET-28a-enterotoxin B、pET-32a-invA和pET-28a-ipaH,并克隆出969 bp的eaeA基因片段、567 bp的tdh基因片段、798 bp的enterotoxin B基因片段、1 041 bp的invA基因片段和771 bp的ipaH基因片段。重组质粒载体经酶切和测序与目标基因序列一致。在E·coliBL21（DE3）株中有质粒表达蛋白37.5 kDa（eaeA）、26 kDa（tdh）、34.5 kDa（enterotoxin B）、41 kDa（invA）、32 kDa（ipaH）。结论本研究成功构建了5种食源性致病微生物毒力基因重组质粒并在原核细胞中高效表达,为下一步获得相应的毒力基因抗体及快速诊断试剂的研制应用奠定了基础。     

人HMGB1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的  构建人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因的原核表达载体,观察表达水平并纯化重组蛋白。方法  根据GenBank中人HMGB1基因序列,用OptimumGeneTM行密码子优化并合成目的基因,经PCR扩增,NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,插入原核表达载体pQE-T7-2的相应位点,构建原核表达质粒pQE-T7-2/HMGB1。经菌落PCR、酶谱分析及序列分析鉴定重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot印迹法鉴定重组蛋白,Ni NTA树脂亲和纯化目的蛋白。结果  成功构建人HMGB1克隆载体和表达载体;表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20%以上,Western blot法显示,重组蛋白能与抗HMGB1抗体和抗His抗体特异结合,亲和层析纯化后纯度达90%以上。结论  成功构建高效稳定的重组人HMGB1原核表达载体,获得纯化人HMGB1蛋白,为进一步研究HMGB1的功能奠定基础。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质.方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx28的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E. coli BL-21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot (WB)分析重组蛋白生物活性.结果:PCR扩增stx2b基因约220bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应.结论:成功克隆EHEC O157:H7 stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157:H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础.     

融合蛋白TOP_3原核表达载体的构建、表达及纯化研究

目的:利用HIV病毒TAT蛋白转导结构域、人缺氧诱导因子1α氧依赖降解结构域以及CASPASE3构建融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:分别构建原核表达质粒pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD、pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3(pET-28a(+)-TOP3);在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白TOP3进行纯化。结果:成功构建了pET-28a(+)-TOP3的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论:融合蛋白TOP3的成功表达及纯化,为该融合蛋白应用于肿瘤的治疗研究奠定了理论基础。     

重组人tau蛋白对神经细胞的毒性作用

目的 观察重组人tau蛋白对神经来源的细胞株SHSY5Y及体外原代培养的神经元是否有毒性作用.方法 将原核表达纯化的重组人tau蛋白加入SH-SY5Y细胞和原代培养的大鼠神经元培养液中,通过观察细胞形态、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖活性、TUNEL染色检测细胞凋亡、免疫荧光染色观察凋亡诱导蛋白CHOP及内质网应激上调蛋白ARMET的表达情况研究tau蛋白对神经细胞生长、增殖和凋亡的影响.结果 随着tau蛋白作用时间的延长,细胞胞体逐渐变圆,突起减少甚至消失,染色质聚集,部分神经元出现了凋亡.MTT检测结果显示tau蛋白可抑制细胞的增殖.同时发现,细胞外的tau作用可诱导内质网应激标志性蛋白CHOP和ARMET的表达.结论 重组人tau蛋白对神经细胞有毒性作用,该作用可能部分与tau诱导的内质网应激有关.     

支原体感染对泌尿生殖系统的影响

支原体是一种介于细菌与病毒之间，目前所知能独立生活的最小、最简单的原核细胞微生物，它没有细胞壁，只有三层膜组成的细胞膜。因其繁殖方式多，且具高度多形性，故而有球状、长丝状、环状、或螺旋状。支原体自然界分布广泛。自1973年Dienes首次从女性生殖道巴氏腺脓肿中分离出人类第一个支原体后至今已从人体内分离出12种支原体，其中从泌尿生殖道检出的支原体就有7种之多，而检出较高而且与泌尿生殖道疾病有关的是解脲支原体，因其所导致的泌尿生殖系统疾病在临床上越来越受到重视，因而对这方面的研究也有了迅速的发展。