黄热病毒17D减毒株在人二倍体细胞2BS株上的传代适应性研究

目的:探讨黄热病毒17D减毒株在人二倍体细胞2BS株上的传代适应性。方法:通过噬斑检测法检测黄热病毒滴度,观察在不同培养条件下和连续传代时黄热病毒17D减毒株在2BS细胞上的增殖情况。结果:黄热病毒17D减毒株在2BS细胞上连续传5代可适应在2BS细胞上的生长,并以病毒感染复数0.005～0.010接种、培养温度在35...     

实验室条件下人角质形成细胞的培养技术

背景:随着角质形成细胞体外培养技术的建立和发展,皮肤不再被认为是单纯的生理屏障,其在机体免疫和内分泌等方面尤为重要。目的:探讨实验室条件下人体角质形成细胞的培养技术,为角质形成细胞的多方面应用提供可靠的细胞来源。设计:开放性实验。单位:解放军第四军医大学西京医院临床免疫科和皮肤科。材料:实验于2003-03/2005-03在解放军第四军医大学西京医院临床免疫科实验室完成。选取同年4月西京医院泌尿外科门诊收治的1例6岁正常男性术后的包皮为角质形成细胞的来源。方法:①对表皮细胞分离过程采取两步消化法:首先运用离散酶对全层皮肤进行低温消化,将包皮皮片浸入质量浓度为2.5g/L的Dispase酶中,4℃过夜,次日分离表皮;第二步采用胰蛋白酶和乙二氨基四乙酸的混合液进行消化。②采用改良的无血清培养技术进行人体角质形成细胞的培养,培养基为人角质形成细胞无血清培养基 2.5mg/L牛垂体浸出液 5μg/L表皮生长因子 438mg/L谷氨酰胺,其中谷氨酰胺能促进角质形成细胞的生长。③将处于对数生长期的细胞进行人角质形成细胞的冻存和复苏,加入无血清培养基制成细胞悬液,调整细胞密度为5×105/mL接种入75cm培养瓶中传代培养。置于显微镜和透射电2镜下进行细胞形态观察。主要观察指标:①原代和传代细胞的生长情况。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况。③角质形成细胞形态学观察结果。结果:①原代和传代细胞的生长情况:初期细胞悬于培养液中,逐渐细胞贴附于培养皿底部。一般在6～24h内开始贴壁,细胞以圆形为主,随着时间的延长伸展成椭圆型。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落或小集簇,四周可见卫星样表皮细胞增殖,多数细胞为多角形,细胞的均质性和透明度加强。5d左右细胞融合范围可达70%,9d左右细胞融合达90%,11d左右细胞完全融合形成细胞膜片。角质形成细胞可在体外稳定培养2～3个月,细胞形态和生长速度无明显改变。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况:将不同代的角质形成细胞分别冻存于液氮罐中,3个月后进行复苏,发现角质形成细胞的形态和生长速度无明显改变。③角质形成细胞形态学观察结果:显微镜下细胞呈典型上皮样特征,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚折光性好。透射电镜下培养的表皮角质形成细胞胞浆内有大量束状张力丝和张力原纤维,可见线粒体和粗面内质网,胞质周边有短的突起,细胞间有桥粒相连等角化细胞所具有的特点。结论:培养的角质形成细胞在多次传代后仍能够保持正常的形态特征,提示改良的培养角质形成细胞的技术可为实验和临床提供可靠丰富的角质形成细胞来源。     

本期专题：胰腺干细胞的分离培养与诱导分化

1小鼠胰腺千细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养,见2009年13卷40期7964～7968页。2昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特异性标志物巢蛋白的鉴定,见2007年11卷7期1285-1283页     

抗人白细胞间素Ⅱ高效价多克隆及单克隆抗体的制备

采用不同免疫方案免疫家免及小鼠制备抗人IL-2多克隆及单克隆抗体．其中以沙门氏菌体吸附方法效果最佳，其免疫效价比福氏佐剂方法高数倍、而抗原用量却仅为前者的1／4。选用强化加强免疫及细胞富集措施，并采用大鼠胸腺混合培养上清替代滋养细胞，一次融合获得106个阳性株。经过自然淘汰试检，筛选出18株稳定分泌抗人IL-2单克隆抗体的杂交瘤，其中未亚克隆化的原始孔细胞在体外连续传代2个月以上，仅三株出现抗体转阴现象。     

用于Hib结合疫苗生产的新型候选菌株的评价

目的 观察b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)760705株在连续传代过程中的稳定性.方法 将Hib 760705株工作种子批菌种连续传代,对第5、第8、第10代Hib培养物进行全面检测,包括培养特性(细菌培养、卫星试验)、染色镜检、生化反应,以检测第5、第8、第10代Hib的生物学特性.同时采用血清凝集试验和聚合酶链反应荚膜分型方法进行b型荚膜多糖稳定性检测.结果 Hib 760705株工作种子批培养物在连续传代过程中具有典型的细菌学特性,能够稳定地产生b型荚膜多糖.结论 Hib 760705株有明确的来源和背景,可以稳定传代,具备作为Hib结合疫苗生产用候选菌株的条件.     

人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养

目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.     

4株志贺菌无抗生素压力下连续传代90次的耐药表型及CRISPR/Cas系统变化

目的 分析无抗生素压力下连续传代90次的4株志贺菌耐药表型及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）基因变化。方法 对临床分离的4株耐药谱不同的志贺菌进行无抗生素压力连续传代90次,传代结束后用琼脂稀释法检测传代前、后志贺菌最小抑菌浓度;用PCR对CRISPR位点进行扩增并测序,CRISPR Finder和Clustal X 2.1分析CRISPR位点的变化。结果 经无抗生素压力传代90次后,4株志贺菌对某些抗生素的敏感性有不同程度的增加：mel-sf1998024/zz对氨苄西林、头孢氨苄、头孢噻肟、氯霉素的耐药性降低,mel-s2014026/sx对诺氟沙星、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2004004/sx对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟、氯霉素、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2013004/bj对氯霉素的耐药性降低;志贺菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj经无抗生素压力传代后,CRISPR3位点3''的重复-间隔序列丢失,其中间隔序列匹配基因的编码产物是Cas蛋白。结论 志贺菌在无抗生素压力下,可降低或丢失对某些抗生素的耐药性。部分志贺菌CRISPR3位点的结构发生了变化,CRISPR3位点与cas基因可能存在共进化。     

人卵巢颗粒细胞体外分离培养后连续传代的观察

目的 观察两种方法分离的人卵巢颗粒细胞(GCs)体外培养后的连续传代情况.方法 选取行辅助生殖技术治疗的不孕患者,收集促排卵后穿刺取卵获得的卵泡液(FF),分别用密度梯度离心法和红细胞裂解法分离人GCs,进行体外培养、扩增及连续传代,并用免疫荧光法对原代及传代后GCs进行鉴定.结果 红细胞裂解法获得的GCs数量较密度梯...     

两种方法纯化胎鼠脑室管膜下区神经干细胞的结果比较

目的 利用有限稀释法和连续传代法纯化体外培养的神经干细胞(neural stemcells,NSCs),并对2种方法纯化后的细胞纯度及增生能力进行比较.方法 机械分离孕龄14.5 d的胎鼠脑室管膜下区细胞,利用有限稀释法和连续传代法纯化NSCs,通过免疫细胞化学法鉴定纯度(Nestin阳性卒)及分化细胞的类型.将2种方法纯化后的第3代NSCs以相同的密度接种后连续培养6周,每周进行细胞计数,绘制生长曲线.结果 有限稀释法和连续传代法纯化NSCs的Nestin阳性率均高于原代NSCs(31.00%±0.02%),有限稀释法的Nestin阳性率(91.00%±0.03%)高于连续传代法(58.80%±0.02%,P<0.05).有限稀释法纯化NSCs的生长曲线一直处于增生趋势,而连续传代法的细胞前3周是上升趋势,以后趋于平缓(P<0.05).结论 有限稀释法能有效纯化体外培养的NSCs,并保持细胞良好增生能力及多向分化潜能,为基因治疗视神经损伤疾病提供大量种子细胞.     

H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。