EPEC O2、O78及融合双价弱毒菌株O2．78（Chl^r Nor^r）ompA基因原核表达载体重组构建

目的构建PThioHisA-ompA重组质粒。方法根据GenBank中大肠埃希菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从大肠埃希菌O2、O78及其融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)序列,进行序列测定及分析。重组PMD-18-ompA经双酶切切下ompA片段,电泳回收;原核表达载体PThioHisA质粒双酶切,回收大片段。再将回收的ompA插入回收大片段原核表达载体PThioHisA上。结果按预期PThioHisA-ompA重组质粒PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在约1kb处有一清晰条带,与预期值相符。结论成功构建PThioHisA-om-pA重组质粒,为致病性大肠埃希菌基因疫苗的抗原筛选和构建奠定了实验基础。     

金葡菌野生株肠毒素B基因克隆及分子特征

目的克隆金黄色葡萄球菌野生株S407030肠毒素B（SEB）基因，并分析其分子特征。方法根据Genebank中金黄色葡萄球菌S6株肠毒素B基因设计1对引物，采用PCR法从金黄色葡萄球菌野生株S407030基因组中扩增目的基因，将目的片段与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB，并转化E．coli DH5 α；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法作序列测定分析，并以ExPasy Proteoic Tools蛋白分析软件预测其编码SEB蛋白的二级结构。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约705bp的基因片段，所构建的阳性克隆重组子PCR及双酶切鉴定与预期结果一致；测序结果表明，克隆的SEB基因含705个碱基，与S6株序列相比无碱基的插入或缺失，同源性为98．4％；存在11个碱基变异，其中7个为无义突变，4个为有义突变（突变位点位于第364，699．899．988位，编码氨基酸变化分别为：Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser、Met→Leu）；所预测的2菌株SEB蛋白的二级结掏基本相同。结论本实验成功克隆了金葡菌野生株S407030SEB基因，其在不同菌株间相对保守；由SEB基因点突变引起的个别氨基酸的改变对SEB生物活性与毒力的影响有待进一步研究。     

应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞*☆

背景：研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞，并应用于各类组织工程和再生医学研究。 目的：结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞，并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。 方法：以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象，经三重酶消化和细胞筛过滤，运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞，予细胞特异标记物以免疫组织化学染色；以有限稀释技术克隆培养的方法，获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。 结果与结论：差速贴壁培养过程中，肌性细胞占比逐渐增高，首次贴壁1 h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养；肌源干细胞需72 h左右贴壁生长，经10 d左右可以增殖为300~500细胞数量的集落，细胞形态以小圆形细胞为主，并有少量梭形细胞，肌源干细胞能够维持形态并持续增殖；应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落，肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性，Sca-1染色阳性，阳性率为(92.3±4.1)%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。