RT—PCR方法在小鼠肝炎病毒检测中的初步应用

采用4株小鼠肝炎病毒,MHV1、MHV3、A59和JHM的混合液人工感染SCID小鼠,接种病毒后1、2、5d分别取小鼠的全血、肝、肺、脑、脾和血清,用组织总RNA抽提试剂盒提取各组织的总RNA,然后用RTPCR方法检测小鼠肝炎病毒,并对各反应产物进行平均光密度测定。结果显示,接种后24h即可检测出血液中的小鼠肝炎病毒,病毒在小鼠体内各脏器出现的先后顺序为血、肝、脾、肺、脑,主要在肝脏进行复制。     

应用HIV-1耐药性基因型检测广东部分地区HIV耐药株

目的利用艾滋病病毒1型(HIV-1)耐药性基因型检测法,在HIV-1感染者中监测HIV-1耐药性病毒株,掌握广东省HIV-1感染者在利用抗病毒药物治疗前是否存在耐药突变及其流行情况。方法从未接受高效抗逆转录病毒联合疗法(HAART)治疗的HIV-1感染者血浆中提取病毒RNA,采用套式PCR扩增目的基因片断,并对扩增片断进行序列测定和分析。结果HIV-1耐药性基因型检测法能够从HIV-1感染者血浆病毒载量大于1 000拷贝/ml以上、CD4低于400以下的样本中扩增到目的片断。在广东省50例未治疗对象中,低中度耐药相关突变例数为2例,占4%;高度耐药相关突变例数为0;总耐药相关突变例数为2例,占4%。结论HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测HIV-1感染者血浆中的耐药性病毒株的存在,并且方法提供的结果准确、可靠。对广东省未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者中耐药突变的检测表明,HIV-1感染者中存在病毒的耐药性突变,也反应了HIV毒株自然变异情况的存在。     

Sonic hedgehog and Glis famliy expression in the human neonatal of congenital esophageal atresia and tracheoesophageal fistula

目的 研究Sonic hedgehog基因及Gli家族在人类先天性食管闭锁并气管食管瘘(esophageal atresia and tracheoesophageal fistula,EA-TEF)的表达特点,探讨EA-TEF病因及发病机制的可能影响因素.方法 食管吻合术中留取22例EA-TEF患儿近端食管盲端及远端气管食管瘘管组织,7例行HE染色,10例行real-time RT-PCR处理,5例行免疫荧光染色处理.观察食管盲端及气管食管瘘管形态上的变化及各指标的差异.结果 ①形态学:瘘管组织内皮下可见粘液腺体,肌层稀疏且肌肉组织结构紊乱；②Shh表达:食管盲端组织中可见表达,瘘管组织中未有表达；③Glis表达:Gli-1、Gli-3mRNA表达无差异,Gli-2mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.05),瘘管中表达低于食管盲袋.结论 气管食管瘘组织具有气管源性特征.EA-TEF的发生可能与Shh信号通路表达下调有关.Gli-2的功能缺失在EA-TEF的发生中可能发挥重要作用.     

BAG-1及NF—κBP65在多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中的表达

目的：通过观察核酸水平Bcl-2结合抗凋亡基因1（Bcl-2-Associated Athanogene 1,BAG—1）及NF—κB P65在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）的表达,探讨BAG-1及NF—κB P65在MM发病机制中的作用及其临床意义,为MM的治疗寻找相关的理论依据。方法：选取皖南医学院附属弋矾山医院2006年10月-2008年10月初诊MM患者为实验组,同时选取骨外伤患者为对照纽,抽取患者骨髓液提取单个核细胞,用于BAG-1及NF—κB P65 mRNA RT—PCR检测。结果：初诊MM患者BAG-1 mRNA在单个核细胞中表达率为71．4％,高于对照组（P=0．007）。NF—κB P65 mRNA在初诊骨髓瘤患者单个核细胞中表达率为75．0％,高于对照组（P=0．004）。BAG-1 mRNA与NF—κB P65 mRNA呈正相关。BAG-1及NF—κB P65高表达的MM患者肿瘤负荷高、与多项临床指标有关。结论：BAG-1及NF—κB P65在MM患者单个核细胞中高表达,与对照组相比差异有统计学意义,与临床多项指标有关,经分析可能参与疾病的发生发展,可作为预后参考指标之一。     

反转录-聚合酶链反应法研究肝星状细胞与细胞间粘附分子-1表达的关系

目的研究肝星状细胞（ＨＳＣ）与细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ１）表达的关系。方法用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流,Ｎｙｃｏｄｅｎｚ密度梯度离心分别分离正常大鼠及四氯化碳实验性大鼠肝纤维化模型中的ＨＳＣ,并进行体外培养,应用免疫组织化学方法和反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术分别观察不同培养时期的ＨＳＣ、正常及造模肝组织中ＨＳＣ的ＩＣＡＭ１的表达。结果正常大鼠新分离的ＨＳＣ中,ＩＣＡＭ１不表达;原代培养第１０天及传代培养第７天的ＨＳＣ表达ＩＣＡＭ１,且随着培养时间的延长ＩＣＡＭ１表达量逐渐增加。四氯化碳实验性大鼠肝纤维化模型中,新分离的ＨＳＣ中即可见ＩＣＡＭ１表达。结论体内动物实验和体外细胞培养表明,ＩＣＡＭ１表达可能与ＨＳＣ活化、肝脏炎性损伤及肝纤维化的发生有关。     

过表达整合蛋白α5β1的SMMC7721细胞株的建立和鉴定

构建过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株。方法应用分子克隆技术和基因转染建立过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株,应用ＲＴ－ＰＣＲ及流式细胞术鉴定ＳＭＭＣ７７２１细胞表面整合蛋白α５β１的表达。结果获得过表达整合蛋白α５／β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株α５．３－７７２１,β１．６－７７２１,α５β１．６－７７２１细胞。结论整合蛋白α５β１基因转染后,ＳＭＭＣ７７２１细胞整合蛋白α５β１的ＲＮＡ及蛋白质表达明显提高。过表达整合蛋白α５β１的ＳＭＭＣ７７２１细胞株的建立有助于研究整合蛋白α５β１在肝癌中的作用     

硅粉纯化水中病毒核酸在PCR方法中作用研究

利用纯腐殖酸制剂,人工制备了污染有脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒及3种病毒混合的水样品,研究了腐殖酸对反转录和 PCR(RT-PCR)的抑制作用及硅粉的去抑制作用。结果显示当水中腐殖酸浓度大干或等于1g/L 时,3种病毒的 RT-PCR 均被抑制,当浓度在10～100mg/L 之间,常规方法提取病毒 RNA、RT-PCR 阴性,而经硅粉纯化处理过的病毒 RNA、RT-PCR 阳性,硅粉能有效去除腐殖酸对 PCR 的抑制;当浓度等于或小于10mg/L RT-PCR 不受影响。结果还同时表明,用6-核苷酸代替病毒特异性引物成功地对混合病毒样品进行了反转录。     

RT-PCR法测定脂肪组织解偶联蛋白mRNA表达水平的探讨

目的：建立解偶联蛋白（ＵＣＰ）ｍＲＮＡ表达水平的竞争ＲＴ－ＰＣＲ测定法;并应用该方法测定ＵＣＰ ｍＲＮＡ在成人腹膜内与腹膜外脂肪组织的表达水平。方法：应用剪接重叠延伸ＰＣＲ（ＳＯＥ－ＰＣＲ）合成中央缺失型ＵＣＰ竞争者ＲＮＡ。ＵＣＰ ｍＲＮＡ与作为内设标准的ＵＣＰ竞争者ＲＮＡ用相同的引物在同一反应体系中进行逆转录反应和ＰＣＲ扩增。通过比较ＵＣＰ ｍＲＮＡ产物和ＵＣＰ竞争者ＲＮＡ产物的放射性信号强度求