人脐血源和骨髓源间充质干细胞神经前体细胞分化的研究

目的 对比研究人脐血和骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外的分离、培养和生物学特性,并观察其分化潜能和形态学变化,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法分别分离纯化成人骨髓和脐血源MSCs,体外培养和连续传代,并在含有2%B27的Neurobasal培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子,将获得的MSCs向神经干细胞定向诱导,利用倒置显微镜连续观察细胞培养、传代和向神经细胞表型转化过程的形态学变化;采用免疫组化和荧光免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定.结果 原代分离的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在接种后48 h贴壁,7 d细胞呈长梭形,有一定的方向性,并达到90%融合;而脐血间充质干细胞(UMSCs)48 h后贴壁,似乎贴的不牢,持续14d才能形成小丛、小簇、小集落,21 d排列才有一定的方向性.培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经前体细胞样表型,免疫组化和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志β微管蛋白(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质相关蛋白(GFAP).结论 人脐血和骨髓中含MSCs,且具备其基本恃征,体外培养UMSCs生长速度比BMSCs缓慢10 d～15 d左右,传代以后的各组细胞生长速度与形态无明显差异.骨髓和脐血来源的MSCs在体外可定向诱导分化为神经细胞.     

神经营养因子信号转导与神经细胞凋亡的分子机制

细胞凋亡(Apoptosis)是一种程序化的细胞死亡过程,其中神经细胞的凋亡对胚胎期神经系统的生长、发育、分化、成熟及生后各种原因所致的脑损伤,神经退行性疾病的发生都起着至关重要的作用。神经营养因子(Neurotrophins,NTS)通过其与相应靶细胞膜受体的活化而引发相关信使分子的级联激活而减缓神经细胞凋亡、促进神经细胞的存活,发挥其生物学功能。对NTS家族信号转导与神经细胞凋亡的分子机制的认识有助于早期干预和治疗各种原因所致神经发育残障,脑损伤及神经退性行疾病。     

大鼠液化石油气中毒后脑细胞形态学改变及GFAP表达的变化

目的观察大鼠液化石油气中毒后脑细胞形态改变及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化。方法采用大鼠液化石油气中毒模型,动物分别于中毒后1、3、7、14、21、28d处死,苏木精-伊红染色观察脑组织神经细胞的动态变化,免疫组化方法检测脑组织GFAP的表达水平。结果大鼠液化石油气中毒后大脑皮质神经元细胞核浓缩、结构不清,随中毒浓度增加,细胞核浓缩更明显,但未见明显神经元坏死迹象。免疫组织化学技术观察显示GFAP表达增加,随中毒浓度升高,GFAP表达亦明显增加。结论液化石油气中毒后大脑皮质神经元形态学改变是认知功能下降的病理基础之一,脑组织GFAP表达的增加是损伤修复的一种表现。     

液化石油气中毒大鼠的行为学与病理研究

目的 观察大鼠急性液化石油气中毒后行为学和病理变化.方法 采用大鼠液化石油气中毒模型、水迷宫实验观察大鼠逃避潜伏期、在无平台水迷宫中第1次穿越平台所在位置的时间和在平台所在象限游泳距离,实验大鼠分别于中毒后2、3、5d处死取脑,HE染色观察神经细胞形态.结果 水迷宫实验中中毒组动物逃避潜伏期明显延长,在无平台水迷宫中第1次穿越平台所在位置的时间明显延长,在平台所在象限游泳距离缩短.光镜下见中毒组大鼠神经元细胞核浓缩、结构不清.结论 液化石油气中毒导致神经元细胞坏死,从而损害大鼠的学习记忆认知功能.     

蛋白激酶C神经保护作用的研究进展

蛋白激酶C属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员,在各种生命现象中发挥着重要的作用。它调控细胞整个生长周期,表达异常会对神经细胞造成毒性,甚至导致细胞凋亡。本文介绍蛋白激酶C在调控神经细胞增殖与凋亡、发挥神经细胞损伤保护及抑制神经毒性中的作用,进一步探讨其可能的分子作用机制,为了解蛋白激酶C在神经系统疾病中的作用提供参考。     

人胎脑组织中低分子抗衰老物质的实验研究

采用细胞内脂褐素测定和体外神经细胞培养这两个基本指标观察了人胎脑组织提取液（Ｆｅｔａｌｂｒａｉｎｅｘｔｒａｃｔｓ，ＦＢＥ）的抗衰老作用。分析表明：ＦＢＥ中分子量小于２０ｋＤａ的组份能预防老龄小鼠脑神经元内脂褐素沉积，该预防作用的原因之一是ＦＢＥ能提高脑细胞线粒体谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活力。ＦＢＥ加入人胚神经细胞培养体系中能促进神经元生长和防止神经突起萎缩。ＦＢＥ有可能成为治疗中枢神经系统变性疾患尤其帕金森病的神经保护药物。     

兔肌源性干细胞分离培养及诱导分化为神经细胞的研究

目的 探讨兔肌源性干细胞(MDSC)分离纯化及诱导分化为神经细胞的方法.方法 取2～3周龄新西兰兔大腿肌肉,采用改进的Preplating技术分离MDSC,并应用流式细胞仪(FCM)、免疫细胞化学检测细胞表型.添加神经生长因子、全反式维甲酸、β-巯基乙醇诱导MDSC分化为神经细胞并运用免疫细胞化学和FCM检测特异性神经巢蛋白(Nestin)的表达.结果 经过连续6d的差速贴壁分离得到小圆形及小菱形细胞,传代后进一步纯化,FCM结果显示这些细胞>90%为desmin+,>90%为bcl-2+,>95%为CD45-.免疫细胞化学显示大多数细胞为desmin+及bcl-2+.诱导后的细胞>90%为Nestin+.结论 采用改进的Preplating技术能很好地分离出MDSC,并能在体外诱导分化为神经细胞,为构建组织工程化尿道海绵体提供种子细胞.     

PCBP1 RNAi重组慢病毒包装及筛选其稳定感染的神经细胞系

目的 PCBP1是真核细胞内的一种桥梁蛋白,具有多种生物学功能。本研究以慢病毒质粒构建PCBP1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,并筛选其稳定感染的神经细胞系,为进一步通过该载体系统探讨PCBP1的具体功能提供有力手段。方法设计合成针对人及小鼠的PCBP1基因的siRNA茎环结构的正反义序列,退火形成双链,与pLenti-Lox3.7载体的双酶切产物连接,以质粒PCR、酶切和DNA测序等方法,对重组克隆进行鉴定以确认目的片段的插入。之后,采用脂质体转染,将慢病毒载体系统的核心载体pLentiLox3.7和包装质粒共转染293T细胞,收获病毒颗粒,分别感染SH-SY5Y细胞,再通过流式分选获得感染不同病毒颗粒的细胞,提取RNA检测PCBP1 mRNA水平。结果检测结果显示PCBP1 siRNA茎环结构序列正确插入pLentiLox3.7载体,并且成功构建PCBP1基因敲低的神经细胞系。结论 PCBP1基因siRNA表达载体及其基因敲低稳定细胞系的成功构建,为进一步研究该基因在相应细胞中的功能奠定了基础。     

局灶脑缺血神经细胞和星形胶质细胞可能不同死亡途径探讨

目的本研究采用电镜和免疫组化的方法观察局灶脑缺血中心区和边缘区细胞死亡形态学变化特征,探讨神经细胞和星形胶质细胞可能存在的不同死亡途径。方法 78只SPF级雄性SD大鼠,随机分为:(1)假手术组6只;(2)电镜对照组2只;(3)免疫组化组30只;(4)电镜实验组10只。3、4组大鼠分别于缺血3h、6h、12h、24h、48h取脑,假手术组和对照组为术后24h取脑。HE染色,GFAP和TUNEL染色,GFAP、TUNEL双标免疫组化染色,图像分析观察上述指标表达情况。结果随缺血时间延长,电镜下可见缺血中心区星形胶质细胞明显肿胀,缺血12h星形胶质细胞核膜破溃,染色质漏出。而神经元电子密度增高,细胞核变形、固缩。缺血24h可见凋亡小体。缺血边缘区各时间点神经细胞的损伤程度呈明显的不一致性。免疫组化显示缺血3h中心区及边缘区均可见TUNEL阳性细胞,以边缘区为主,随缺血时间延长边缘区阳性细胞渐增多,中心区TUNEL阳性细胞递减,缺血24h后中心区罕见阳性细胞。缺血6h中心区GFAP阳性细胞明显减少,缺血12h中心区罕见阳性细胞,缺血24h后边缘区可见大量GFAP阳性细胞与中心区形成明显的阴阳分界线。GFAP和TUN...     

无血清培养骨髓基质干细胞向神经细胞诱导分化条件的优化

目的：探索无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞诱导分化条件的优化方案,为BMSCs应用于脊髓损伤的临床治疗创造条件.方法：用含2% Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增人BMSCs,采用流式细胞仪检测培养细胞的表面标志,再以全反式维甲酸、β-巯基乙醇和神经生长因子为主要成分组成6种诱导液诱导BMSCs向神经细胞分化,镜下观察细胞形态学变化,用抗人β微管蛋白（β-Tubulin）抗体和抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫荧光染色鉴定诱导后的神经细胞,通过流式细胞仪检测诱导后细胞的凋亡率.结果：无血清培养的BMSCs在6种诱导条件下均可不同程度地分化为神经样细胞,镜下可见诱导后细胞表现为神经细胞形态特征,免疫荧光染色显示β-Tubulin和GFAP均有阳性表达,诱导后细胞发生不同程度的凋亡,其中全反式维甲酸和神经生长因子组成的复合诱导液的诱导效率较高,诱导后细胞凋亡率较低.结论：全反式维甲酸与神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经样细胞,是较佳的诱导条件.