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1.
《Allergologia et immunopathologia》2019,47(4):357-364
IntroductionAmaranthus retroflexus (Redroot Pigweed) is one of the main sources of allergenic pollens in temperate areas. Polcalcin is a well-known panallergen involved in cross-reactivity between different plants. The aim of this study was the molecular cloning and expression of polcalcin, as well as evaluating its IgE-reactivity with A. retroflexus sensitive patients’ sera.MethodsAllergenic extract was prepared from A. retroflexus pollen and the IgE-reactivity profile was determined by ELISA and immunoblotting using sera from twenty A. retroflexus sensitive patients. Polcalcin-coding sequence was amplified by conventional PCR method and the product was inserted into pET-21b(+) vector. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by metal affinity chromatography. The IgE-binding capability of the recombinant protein was analyzed by ELISA and immunoblotting assays, and compared with crude extract.ResultsOf 20 skin prick test positive patients, 17 patients were positive in IgE-specific ELISA. Western blotting confirmed that approximately 53% of ELISA positive patients reacted with 10 kDa protein in crude extract. The A. retroflexus polcalcin gene, encoding to 80 amino acid residues was cloned and expressed as a soluble protein and designated as Ama r 3. The recombinant polcalcin showed rather identical IgE-reactivity in ELISA and western blotting with 10 kDa protein in crude extract. These results were confirmed by inhibition methods, too.ConclusionThe recombinant form of A. retroflexus polcalcin (Ama r 3) could be easily produced in E. coli in a soluble form and shows rather similar IgE-reactivity with its natural counterpart. 相似文献
2.
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法是将PCR方法与逆转录法结合应用,可快速高效地扩增某一基因的全cDNA。类胰岛素生长因子-I(IGF-I)在人染色体中只有一个基因,全长超过45kb,并有内含子,其cDNA却只有几百个bp,为了表达得到IGF-I,本文利用RT-PCR方法,从胎肝提出的混合mRNA中,筛选并扩增了IGF-I的cDNA。经过分子克隆与测序,证明不需制备胎肝cDNA库,即可快速获得IGF-I的cDNA。 相似文献
3.
4.
rhTPO在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:探讨人促血小板生成素(human thromlbopoietin,hTPO)在大肠杆菌中表达、分离纯化及生物学活性初步鉴定。方法:利用RT-PCR法从人胎肝细胞中扩增目的基因片段,将其定向插入pQE30表达质粒T5启动子下游的多克隆区,转化大肠杆菌M15,得到pQE30-TPO的工程菌,诱导目的蛋白表达、纯化。将表达产物给血小板减少模型小鼠尾静脉注射,观察注射后不同时间血小板量的改变。结果:经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside IPTG)诱导培养,该工程菌可以产生单一特异性的高表达蛋白条带。将纯化后的表达蛋白注射小鼠,结果显示对实验性小鼠血小板减少症具有一定的治疗作用。结论:在大肠杆菌中成功地高效表达了重组hTPO,该产物具有促血小板生成的活性。 相似文献
5.
目的:构建表达小鼠轮状病毒(EDIM)EW株VP7基因的重组腺病毒,以在小鼠模型上研究轮状病毒的免疫保护机制。方法:用RT-PCR方法扩增EDIM VP7全长cDNA并进行基因序列分析,将所得的VP7基因片段插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttleCMV-EVP7,将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得重组腺病毒质粒pAdCMV-EVP7,将该质粒线性化后转染293细胞包装重组腺病毒rvAdEVP7。以rvAdEVP7感染293细胞,并分别应用电子显微镜、PCR、RT-PCR和Western blot等方法观察rvAdEVP7的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性。结果:获得了小鼠轮状病毒的全长cDNA,重组腺病毒rvAdEVP7具有典型的腺病毒形态,PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdEVP7中确有特异性的VP7基因稳定整合;有较好的遗传稳定性;感染293细胞后能有效转录;可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7。结论:成功构建含VP7基因的重组腺病毒rvAdEVP7,为进一步研究轮状病毒的免疫保护机制打下了基础。 相似文献
6.
人细胞色素p450IA1基因cDNA的克隆和鉴定 总被引:5,自引:1,他引:4
在用3-甲基胆蒽诱导培养人羊膜FL细胞24h后,抽提细胞总RNA并直接合成cDNA第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物,采用PCR技术特异性地扩增Cyt p50IA1 cDNA。30个循环后琼脂糖凝胶电泳显示1.5Kb大小片段,长度与预计相符。Southern杂交结果证实此片段确为Cyt p450IA1 cDNA。将此片段克隆至质粒pGEM-3Z并进行部份序列分析。结果显示克隆片段包含Cyt p 相似文献
7.
人自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因克隆与鉴定 总被引:2,自引:2,他引:0
目的:P58.2基因克隆与鉴定。方法:采用RT—PCR技术,从正常人外周血单个核细胞中扩增自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因全长cDNA,经酶切后构建重组克隆载体,双酶切和测序鉴定。结果:RT—PCR获得了预期的扩增产物P58.2全长cDNA,成功构建了pSPORT1-P58.2重组克隆载体,酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与GenBank登记的人P58.2cDNA全长碱基序列一致。结论:pSPORT1-P58.2重组克隆载体构建成功;P58.2基因序列与文献报道一致,为下一步构建表达载体和基因转染等工作打下良好的基础。 相似文献
8.
牛IL-18基因的克隆及遗传进化分析 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:克隆牛白细胞介素18(IL-18)全基因,并对其进行序列分析。方法:从ConA刺激培养的牛外周血淋巴细胞提取总RNA,利用巢式RT-PCR方法扩增出牛IL-18全长cDNA,将其克隆到pMDl8-T载体上,测序后进行序列分析。结果:成功地克隆到了牛IL-18全基因,序列分析表明,实验中所克隆到的牛IL-18序列与GeneBank所登录的牛IL-18核苷酸序列及其推导氨酸序列同源性分别是99.5%和99%。与人、猕猴、野猪、山羊属、马等核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分别在84.9%-99.5%和74.9%~99%之间,研究结果在国内还未见报道。结论:成功地从牛外周血中克隆到了牛IL-18的基因,其全长为598bp。 相似文献
9.
10.
目的 构建携带 eap 基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组 EAP 融合蛋白。 方法 PCR 法扩增金黄色葡萄球菌基因组 DNA,回收、 纯化的扩增产物与 pMD18-T 载体相连接得重组质粒 pMD18-T-EAP,转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;未酶切组作为对照组重组质粒 pMD18-T-EAP 和 pET28a(+)表达载体分别用 Nde I 和 Xho I 限制性内切酶双酶切、连接,转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;空载体作为对照组。用不同浓度(终浓度 1、2、4、8 mmol/L)和不同诱导时间(1、2、3、4、5、6 h)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性重组菌进行表达优化,分别取 E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用 MagneHisTM 蛋白纯化系统纯化重组 EAP 融合蛋白,并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。 结果 所获 eap 基因与 GeneBank 的基因序列同源性 > 99%;氨基酸同源性达 100%。重组质粒经 IPTG 诱导,阳性重组菌转化子均有表达;当吸光度(A )值等于 0.6 ~ 0.8 时,相对分子质量约 70 000 处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌 pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚,沉淀中几乎看不到。终浓度 1 mmol/L 为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG 诱导 1 h 重组 EAP 融合蛋白有一定量的表达,随着时间的延长,表达量增加不明显,3 h 时的表达量达最高,之后,蛋白表达量变化不明显。表达的重组 EAP 融合蛋白含量占全菌体蛋白的 29.6%。 结论 成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组 EAP 融合蛋白,为进一步研究以 EAP 蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。 相似文献