碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备

目的:从维甲酸诱导的白血病细胞系HL60中,克隆编码219个氨基酸的新基因restin,构建原核表达载体、制备抗血清并进行初步应用。方法:采用PCR技术,以维甲酸诱导的白血病细胞的cDNA为模板,扩增出restin的编码区。将其克隆入大肠杆菌表达载体中。经过温度诱导获得restin表达蛋白。利用SDS-PAGE纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备该蛋白的抗血清。以该抗体做间接免疫荧光,初步观察restin在COS-7细胞内的表达分布。结果:大肠杆菌中表达的restin蛋白的Mr为26000。将其初步纯化后免疫新西兰白兔制备的抗血清,用Westernblot检测其效价为1∶800。间接免疫荧光显示,restin蛋白主要分布在细胞核内。结论:成功地制备抗restin的抗体,为进一步研究restin蛋白在组织中的表达、细胞内亚定位以及信号转导通路提供了前提条件。     

restin及其位点缺失体的表达载体构建、表达及分析

目的 构建人restin及其核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ,CKⅡ)作用位点缺失体基因rt1、rt2的真核表达载体并检测其在非洲绿猴肾细胞COS-7中的表达.方法 应用RT-PCR方法从体外培养的人胚肾细胞HEK293的mRNA中扩增出restin及其缺失体基因的编码区,克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)3×flag,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测restin、rt1、rt2的表达及其亚细胞定位情况,从而确定功能位点缺失是否影响了Restin的核定位.结果 测序证实PCR扩增得到的restin、rt1、rt2基因编码区序列正确;脂质体法转染COS-7细胞后检测到预期目的 蛋白的表达.截取NLS/CKII位点阻滞了Restin的细胞核定位.结论 成功构建了restin及其缺失体基因的真核表达载体并使其在COS-7细胞中表达并检测到功能结构域的缺失引起蛋白Restin的核定位变化.     

Patent focus on cancer chemotherapeutics. II Angiogenesis agents: April 2000 - September 2000

Angiogenesis refers to the formation of capillary blood vessels from existing blood vessels: a process that is believed to be critical for tumour growth and metastasis. Angiogenesis inhibition represents a new approach to cancer chemotherapy with several agents and approaches now entering late clinical development. This review summarises the key aspects of recent patent applications referring to inhibitors of angiogenesis that have been published between April and September 2000. The review covers the main mechanism-based approaches such as MMPI, integrin antagonists, urokinase inhibitors and inhibitors of the growth factor signalling pathways of fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and Tie-2/Tek. Applications referring to endogenous inhibitors such as endostatin or angiostatin are also included, as are selected natural products that have data suggesting a link to angiogenesis-specific mechanisms of action.     

全反式维甲酸对乳腺癌MCF-7细胞周期和增殖活性的影响及restin基因表达的初步研究

目的:检测全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)在乳腺癌MCF-7细胞周期、增殖、分化和凋亡过程中的作用,以及对。restin基因表达的影响,从而为研究其功能提供线索。方法:用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期的变化;MTT 法检测细胞增殖活性;RT-PCR检测restin基因表达。结果:在ATRA诱导下,细胞出现G1期阻滞和生长抑制,增殖活性下降,restin基因开始表达,并呈增长趋势。结论:在ATRA诱导MCF-7细胞分化、凋亡过程中,ATRA能使MCF-7细胞 G1期阻滞,并能抑制MCF-7细胞生长,促使其凋亡,restin基因参与细胞周期的调控,特别是细胞凋亡。     

血管发生抑制因子 restin的克隆表达及其抗血管活性的初步研究

目的：克隆人血管发生抑制因子restin(hRs)，在E.coli中融合表达，并测定其抗血管活性。方法：用RT-PCR法从中国人胎盘组织中扩增hRs基因，重组人pGEM-T载体中并测定鉴定，构建原核表达载体pGEX-hRS，表达融合蛋白GST-hRS。融合蛋白经亲和纯化及凝血酶切后，采用鸡胚绒毛膜尿囊膜试验检测其抗血管生成活性。结果：RT-PCR产物为564bp，测序结果与Genbank中胶原XV(COL15A1)的C端序列一致，但在21位（TCT→TCG）引起丝氨酸的同义突变，82位（ACA→TCA）引起丝氨酸突变为苏氨酸。诱导表达的人GST-hRS融合蛋白经凝血酶切后，分子量为20kD，具有抗血管生成活性。结论：hRS的成功克隆、表达为抗血管生成治疗实体瘤的研究奠定了实验基础 。     

Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性

目的：扩增细胞静息因子（restin）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨其对全反式维甲酸（alltrans retinoic acid,ATRA）刺激的反应．方法：①对restin基因上游约2000bp基因组序列进行计算机生物信息学分析．②利用PCR技术扩增restin基因上游序列,将其克隆入pG5-luc中,插入荧光素酶报告基因上游,取代5个GAL-4结合位点及腺病毒启动子,构建Rp—luc质粒．③将构建的质粒转染入HeLa细胞,ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达．结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列,已将该序列插入到荧光素酶基因的上游;ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rp—luc,荧光素酶表达明显增加．结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统,为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础．