针对MAGE-1基因RNAi在恶性胶质瘤SHG-44细胞中的作用研究

目的构建抑制黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)的siRNA表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞中对MAGE-1基因表达的干涉作用。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNA干涉(RNAi)质粒载体。利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后SHG-44细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干扰效果。结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成功插入到预计位点,并且序列与预期完全一致。稳定转染后G418筛选出的SHG-44多克隆细胞MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干涉作用。结论成功构建了针对MAGE-1基因的siRNA表达载体,抑制SHG-44细胞中的MAGE-1分子的表达。     

RNA干扰基因敲除MAGE-1在恶性胶质瘤U87细胞中的初步研究

目的：通过构建抑制MAGE-1的短片段双链核糖核酸（siRNA）表达载体，鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系U87细胞中对MAGE．1基因表达的干涉作用。方法：化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE—1基因寡核苷酸链，克隆至经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上，重组构建核糖核酸干扰（RNAi）质粒载体。利用RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜，检测经稳定转染后胶质瘤U87细胞中MAGE-1的表达，以了解siRNA的干涉效果。结果：重组构建的pSUPER—MAGE—1载体经双酶切、电泳及插入基因片段序列分析，表明寡核苷酸链成功地插入至预计位点，且序列与预期完全一致。稳定转染后G418筛选出的U87多克隆细胞MAGE-1的表达经RT—PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测，2对siRNA均有较明显的干扰作用。结论：载体的成功构建并能对U87细胞中的MAGE—1分子进行RNAi，为进一步研究MAGE—1在肿瘤中的作用，分析基因功能，展开肿瘤基因治疗奠定了基础。     

抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1 RNA干扰系统的构建

目的构建抑制血管内皮生长因子（VEGF）活性的小干扰RNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅢ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢH1启动子下游,获得重组pSUPER-H1-VEGF质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组质粒经EcoRⅢ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全一致。结论重组pSUPER-H1-VEGF载体成功构建,开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建

目的 构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体。方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒，化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列，各64个碱基。退火、克隆到经BgiⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游，获得重组pSUPER-H1质粒。转化感受态大肠杆菌．挑选阳性克隆，抽取重组质粒，EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌。经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析，表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点，经测序鉴定，表明序列完全一致。结论重组pSUPER-H1载体的成功构建，为进一步研究神经生长因子活性打下基础。同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性

为了探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体是否具有抑制HeLa细胞端粒酶活性的能力，人工合成2条64个核苷酸（nt）的片段，其中19nt与hTERT基因1789-1807位碱基同源，将其退火、连接到质粒psUPER中，构建psUP—hTE。在psUP—hTE基础上，把该质粒的启动子和64nt插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP—C1中生成pEGFP—hTE。从而获得新霉素抗性筛选质粒。将pEGFP—hTE用脂质体转染HeLa细胞，G418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代，用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、HeLa细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力。结果显示，pEGFP—hTE转染的HeLa细胞与对照组比较，hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38％，但细胞增殖能力没有明显改变。以上结果表明，pEGFP—hTE能通过RNA干扰（RNAi）途径特异性抑制HeLa细胞hTERT基因的表达，从而有效抑制细胞端粒酶话性，这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径。     

靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的利用siRNA表达载体构建靶向人类心脏发育候选基因hole的pSUPER RNAi载体系(pSUPER-hole)及筛选稳定产毒的细胞克隆。方法化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向人类心脏发育候选基因hole的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSU-PER-hole)。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞H9c2,经过puro抗生素的筛选,建立稳定产生逆转录病毒的细胞模型,采用RT-PCR检测其抑制效果。结果 pSUPER-hole载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。重组载体转染包装细胞,筛选的细胞克隆均可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。RT-PCR检测表明pSUPER-hole能成功抑制hole基因的表达。结论靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体构建成功。     

抑制端粒酶活性的pSUPER RNAi系统的构建

目的 构建抑制端粒酶活性的siRNA表达载体。方法 化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向端粒酶hTERT基因的寡核苷酸，各64个碱基，退火，克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切同时CIP处理后的pSUPER载体的polⅢH1启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立非特异对照．结果 重组构建的pSUP—hTE载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明64个碱基成功插入到预计位点，并且序列完全一致。结论 载体的成功构建，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。同时使我们发展了在体内合成siRNA的方法，这项技术能广泛的用在分析基因功能、肿瘤治疗等，更加便捷地把RNAi技术用于细胞培养和哺乳动物研究。     

重组质粒pSUPER-HBs RNAi的构建及筛选

目的:利用pSUPER-RNAi载体系统进行HBs RNAi序列的初步筛选和干扰效果鉴定。方法:设计并合成针对HBs基因区的3条siRNA(HBs-siRNA1、HBs-siRNA2、HBs-siRNA3),构建3种重组载体pSUPER-HBs-siRNA,与HBV质粒同时瞬转人胚肾293T细胞,72 h后观察转染效果,实时定量PCR和ELISA法鉴定3种干扰序列对HBs的干扰效果,筛选最佳干扰序列。结果:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siRNA,能高效转染人胚肾上皮细胞293T,转染效率在70％以上；实时定量PCR和ELISA法结果均显示HBs-siRNA2可有效抑制HBs的表达,抵制率可达80%,而HBs-siRNA1、HBs-siRNA3干扰效果不显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siRNA,筛选出其中能有效抑制HBs基因表达的pSUPER-HBs-siRNA2序列,为后续研究奠定了基础。     

抑制Smad3的pSUPER RNAi系统的构建和活性鉴定

目的:构建抑制Smad3的shRNA表达载体.方法:化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经BgL Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切同时经牛小肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,CIP)处理后的pSUPER载体的poly Ⅲ H1启动子的下游,重组构建RNA干扰(RNA induced interference,RNAi)质粒,同时设立错义寡核苷酸作为非特异性对照.并将所构建的pSUPER Smad3转染到人类肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC),检测其抑制效果.结果:重组构建的pSUPER Smad3载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.体外活性鉴定表明其能成功地抑制Smad3的基因和蛋白表达,却不影响Smad2的表达.结论:载体成功构建,其在体外抑制效率高,且特异性好.     

人类心脏发育候选基因KLHL31RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类心脏发育候选基因KLHL31表达的pSUPER RNAi载体( pSUPER-KLHL31).方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向心脏发育候选基因KLHL31的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pS...