Apoptosis and its pathway in X gene-transfected HepG2 cells

AIM: To investigate the effect of hepatitis B virus (HBV) X gene on apoptosis and expressions of apoptosis factors in X gene-transfected HepG2 cells. METHODS: The HBV X gene eukaryon expression vector pcDNA3-X was transiently transfected into HepG2 cells by lipid-media transfection. Untransfected HepG2 and HepG2 transfected with pcDNA3 were used as controls. Expression of HBx in HepG2 was identified by RT-PCR. MTT and TUNEL were employed to measure proliferation and apoptosis of cells in-three groups. Semi-quantified RT-PCR was used to evaluate the expression levels of Fas/FasL, Bax/Bcl-xL, and c-myc in each group. RESULTS: HBV X gene was transfected into HepG2 cells successfully. RT-PCR showed that HBx was only expressed in HepG2/pcDNA3-X cells, but not expressed in HepG2 and HepG2/pcDNA3 cells. Analyzed by MTT, cell proliferation capacity was obviously lower in HepG2/pcDNA3-X cells (0.08910±0.003164) than in HepG2(0.14410±0.004927) and HepG2/pcDNA3 cells (0.12150±0.007159) (P<0.05 and P<0.01). Analyzed by TUNEL, cell apoptosis was much more in HepG2/pcDNA3-X cells (980/2 000) than HepG2 (420/2 000), HepG2/pcDNA3 cells (520/2 000) (P<0.05 and P<0.01). Evaluated by semi-quantified RT-PCR, the expression level of Fas/FasL was significantly higher in HepG2 cells transfected with HBx than in HepG2 and HepG2/ pcDNA3 cells (P<0.05 and P<0.01). Bax/Bcl-xL expression level was also elevated in HepG2/pcDNA3-X cells (P<0.05 and P<0.01). Expression of c-myc was markedly higher in HepG2/pcDNA3-X cells than in HepG2 and HepG2/pcDNA3 cells (P<0.05 and P<0.01). CONCLUSION: HBV X gene can impair cell proliferation capacity, improve cell apoptosis, and upregulate expression of apoptosis factors. The intervention of HBV X gene on the expression of apoptosis factors may be a possible mechanism responsible for the change in cell apoptosis and proliferation.     

人VEGF165基因转染人外周血内皮祖细胞的实验研究

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染对人外周血内皮祖细胞(EPCs)的影响.方法 体外分离、培养、鉴定人外周血EPCs.实验分脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组,pcDNA3.1空质粒转染组,窄白对照组.ELISA法和硝酸还原酶法分别测定各组上清液中VEGF和一氧化氮(NO)的含量;噻唑蓝(MTT)检测它们对EPCs增殖的影响.结果 FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清液中VEGF和NO表达量明显高于其他两组(P＜0.01);VEGF质粒转染对EPCs的增殖无明显影响.结论 人外周血EPCs可以成功转染hVEGF165基因.同时能表达一定浓度的VEGF蛋白,并可促进NO的分泌,而对EPCs的活性无明显影响.该研究为进一步研究VEGF165基因和EPCs结合治疗缺血性疾病提供了实验依据.     

间隙连接蛋白26-EGFP载体的构建与表达

目的：构建间隙连接蛋白(connexin，Cx)26-EGFP真核表达载体，观察其在细胞内的表达和功能情况。方法：经RT-PCR获得Cx26基因全长片段，重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2中，经脂质体转染至宫颈癌Hela细胞中，通过激光共聚焦显微镜、免疫细胞化学方法、蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达，应用荧光染料(Lucifer Yellow)细胞划痕法检测细胞间间隙连接通信状态。结果：转染细胞有增强绿色荧光蛋白及Cx26的表达，细胞间间隙连接通讯恢复。结论：融合表达增强绿色荧光蛋白后，不影响间隙连接蛋白的功能，在间隙连接蛋白的研究中，pEGFP-N载体可以作为一个优选载体。     

胰岛素样生长因子-1基因转染骨髓间质干细胞移植对糖尿病大鼠骨折愈合的影响

目的 观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染的骨髓间质干细胞(BMSCs)移植对糖尿病大鼠骨折愈合的影响,探讨糖尿病骨折的基因疗法.方法 Wistar雄性6周龄大鼠50只,随机分为对照组、实验组,链脲佐菌素诱导为糖尿病模型后均造成右侧胫骨骨折,体外高糖环境下Ad-IGF-1转染BMSCs,将相应组别的BMSCs移植于骨折局部.于1、2、3、4、6周摄X线,取局部骨痂行苏木素-伊红(HE)染色,并免疫组织化学检测骨痂中IGF-1,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IGF-1.结果 第4周骨痂IGF-1灰度值:实验组为103±5,对照组为109±4(P＜0.05).第4周血清IGF-1浓度:实验组为(668.80±8.07) ng/L,对照组为(569.20±9.31) ng/L(P ＜0.01).结论 IGF-1基因转染的BMSCs移植能促进糖尿病大鼠的骨折愈合.     

基因治疗脊髓损伤中Ad（腺病毒）-NGF（神经生长因子）的应用研究

目的：应用Ad-NGF转染成纤维细胞治疗脊髓半切模型大鼠探讨在基因治疗脊髓损伤中腺病毒作为载体介导的NGF对脊髓损伤的治疗价值。方法：主要材料为Ad-NGF,293细胞,成纤维细胞,大鼠等。成纤维细胞与Ad-NGF悬液混合培养,将细胞注射至脊髓半横切损伤模型大鼠局部。结果：NGF因子在体外实验组可检测到。Ad-NGF转染组单位面积上神经轴突数量比对照组多。结论：NGF因子在体外实验组得到表达,体内修饰组有NGF表达。证实Ad-NGF转染成纤维细胞通过促进脊髓损伤大鼠神经轴突的生长促进损伤神经功能的恢复。     

沉默CDKN1A基因对鼻咽癌放射抗拒性CNE-2R细胞放射敏感性的影响

目的：探讨CDKN1A基因的表达与鼻咽癌放射敏感性的关系。方法构建慢病毒表达载体LV-CDKN1A-RNAi并转染鼻咽癌放射抗拒性CNE-2R细胞,设转染LV-CDKN1A-RNAi慢病毒的CNE-2R细胞为实验组,转染阴性对照慢病毒的CNE-2R细胞为阴性对照组,未转染的CNE-2R细胞为空白对照组。用CCK-8法、细胞克隆形成实验及流式细胞术分别检测各组细胞增殖、放射敏感性及细胞周期的变化。结果成功构建了CDKN1A基因沉默的CNE-2R细胞,CCK-8法检测显示实验组CNE-2R细胞在照射6 Gy后生长受到抑制,且随时间延长其抑制作用更为明显。细胞克隆形成实验显示实验组CNE-2R细胞放射敏感性增强（放射增敏比为SER=1.24）。流式细胞术检测显示实验组与对照组细胞相比, G0/G1期和G2/M期细胞分布在X射线照射6 Gy前后明显改变（P约0.05）。结论 CDKN1A基因沉默能增强鼻咽癌放射抗拒性CNE-2R细胞的放射敏感性,CDKN1A基因的表达可能与鼻咽癌放射敏感性相关,有望成为鼻咽癌治疗的新靶点。     

反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体，转染肝癌细胞，Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低，流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达，同时转染了pVAXⅠ-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多。结论DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多。     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及诱导成骨的研究

目的探讨骨形成蛋白7（BMP7）重组腺病毒异位诱导成骨的作用。方法将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP7重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒,然后在裸鼠小腿肌肉中进行异位诱导成骨实验。结果经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒pAdTrack-BMP7和BMP7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。组织学观察显示2周时实验局部大量纤维样细胞聚集,软骨细胞分化;5周时骨小梁形成,软骨细胞已退化。结论BMP7重组腺病毒的构建以及其异位诱导成骨的成功,为BMP7基因治疗的研究提供了确切的实验依据。     

体外转染PTEN抑制胆管癌QBC939细胞生长及下调mTOR表达的研究

目的研究信号转导通路P13K／AKT／PTEN／mTOR中抑癌基因PTEN在体外对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用，及对下游mTOR表达的影响。方法用携带有野生型PTEN和突变型PTEN的真核表达载体及空载质粒转染QBC939；用Western blot检测转染后PTEN蛋白的表达及蛋白激酶B磷酸化的变化；流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡情况，及对下游mTOR表达的影响。结果野生型PTEN转染成功后的QBC939细胞中PTEN明显上升，磷酸化AKT明显下降，mTOR表达也明显下调；而突变型PTEN转染后的细胞中PTEN上升，但磷酸化AKT的变化不明显，mTOR的表达亦无明显变化。结论PTEN通过磷酸化AKT使之活化，进一步使下游的mTOR同步下调，继而调节肿瘤细胞周期和细胞凋亡。在PI3K／AKT／PTEN／mTOR信号转导途径中，PTEN与mTOR通过AKT的磷酸化有密切关系。     

Deltal基因转染人牙髓干细胞牙本质形成能力的研究

目的探讨Notch配体Delta1基因转导的人牙髓干细胞（dental pulp stem cell,DPSC）在裸鼠皮下牙本质的新生能力。方法以Delta1基因转染的第2代人DPSC作为实验组,空载体转染DPSC及单纯DPSC作为对照组,分别与纳米羟基磷灰石/胶原（nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC）复合物载体材料复合,倒置荧光显微镜和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长。将实验组和对照组细胞分化诱导后3d制成细胞悬液,按5×10^7/ml接种于材料表面（100μl/块）,体外培养48h。将细胞-材料复合物移植于8只SPF级8周龄BAL B/C-nu/nu雌性裸小鼠背部皮下,术后8周以组织学、免疫组织化学等方法检测牙本质生成情况。结果倒置荧光显微镜观察实验组材料表面及其孔隙内大量细胞生长,表达明亮绿色荧光。扫描电镜观察实验组细胞在载体材料的多孔间隙内大量增殖,细胞伸展良好,分泌大量细胞外基质;而对照组载体内细胞数量则较少。体内移植实验组均可见牙本质-牙髓复合物形成,新生成牙本质样细胞牙本质涎磷蛋白表达阳性;对照组均以纤维结缔组织为主,仅2块移植物有少量牙本质样物质形成。结论DPSC可作为Delta1基因的受体细胞,与nHAC复合后具有成牙本质能力。