Ⅰ类整合子在多重耐药铜绿假单胞菌中的分布与结构分析

目的 了解分离于镇江地区的铜绿假单胞菌对13种常用抗生素的耐药率;明确Ⅰ类整合子基因盒结构及其在耐药基因播散中的作用.方法 采用K-B纸片法检测71株铜绿假单胞菌的耐药率;煮沸法提取71株铜绿假单胞菌基因组DNA;PCR扩增Ⅰ类整合子基因,并通过测序分析其所携带耐药基因盒.结果 71株铜绿假单胞菌对临床常用的13种抗生素的耐药率在18.3%～77.5%不等;Ⅰ类整合子检出率为38%,包括aadB、aac(6')-Ⅱ、PSE-Ⅰ、dfrA17和aadA5 5种基因盒,其中最常见者为dfrA17和aadA5.Ⅰ类整合子阳性菌株对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、左氧氟沙星、环丙沙星等10种抗生素的耐药率明显高于整合子阴性菌株.结论 不同铜绿假单胞菌临床株对13种常用抗生素的耐药率各不相同,整合子阳性菌株耐药率明显高于整合子阴性菌株,提示Ⅰ类整合子是铜绿假单胞菌多重耐药的重要因素.     

整合子中氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用

目的 制备氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶[AAD(3″)]特异性抗血清,并探讨其在检测第1类整合子8种不同可变区启动子(PcS、PcH2、PcH1、PcW、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 -P2和PcW-P2)下游基因盒中aadA2基因表达水平的应用价值.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增aadA2基因,并克隆至表达载体pET19b中,诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔制备抗AAD(3″)特异性抗血清.以制备的抗AAD(3″)抗血清为一抗,用免疫印迹法(WB)检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平,用微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JM109的最低抑菌浓度(MIC).结果 成功构建重组的AAD(3″)蛋白表达质粒pET1 9b-aadA2,经测序确认转化大肠埃希菌BL21( DE3)获得1株高表达可溶性重组AAD(3″)蛋白的工程菌株,发酵后用镍柱纯化获得纯度＞90％的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得效价＞ 1∶100 000的抗AAD(3″)特异性抗血清.WB检测8种不同可变区启动子下游aadA2基因翻译产物AAD(3″)蛋白的表达水平,设定启动子PcW下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平为1,重复3次测得启动子PcS、PcH2、PcH1、PcS-P2、PcH2 -P2、PcH1-P2及PcW-P2下游AAD(3″)蛋白相对表达水平依次为12.9±2.3、9.1±1.0、2.0±0.4、16.0±1.3、14.1±1.3、10.5±0.7、8.9±1.7,且不同可变区启动子下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.421,P＜0.01).微量肉汤稀释法重复3次测得链霉素对含启动子PcS、PeH2、PcH1、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 P2、PcW、PcW-P2及其下游aadA2基因重组质粒的大肠杆菌JM109的MIC平均值依次为256、256、64、128、32、128、4、64 mg/L,表明不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水平不同可赋予宿主细菌对链霉素产生不同水平的耐药.结论 成功纯化出可溶性重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD(3″)特异性抗血清,为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础.不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平明显不同,赋予宿主细菌对相应抗菌药物的耐药水平明显不同,因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时,应重视可变区启动子分类方面的研究.     

不同年代铜绿假单胞菌1型整合子结构比较

目的研究1992-1996年和2003-2005年两个时间段90份铜绿假单胞菌1型整合子结构，比较其结构差异，以了解不同年代1型整合子变化趋势。方法用常规和长片段PCR方法扩增1型整合子及耐药基因，并对PCR产物进行测序和GenBank比对分析。结果41份1992—1996年间样本有13份检出1型整合子结构，长片段PCR扩增1型整合子DNA平均长度为1868bp，平均包含2个耐药基因，包括qaeE△1（n=6）、sul1（n=14）、aadA1（n=2）、aadB（n=1）、PSE-1（n=2）和tetA（n=1）等6种耐药基因，形成5种耐药基因盒组合。49份2003-2005年间样本中有19份检出1型整合子结构，长片段PCR扩增产物平均长度为3383bp，平均包含3．6个耐药基因，包括qaeE△1（n=18）、sul1（n：25）、aadA1（n=6）、aadB（n=7）、aaeA4（n=2）、PSE-1（n=3）、VEB-1（n=4）、OXA10（n=1）、cm1A（n=1）和tetA（n=2）10种耐药基因，形成9种耐药基因盒组合。结论根据整合子碱基数量和所携带耐药基因盒数量，发现2003--2005年间检出的1型整合子结构比1992—1996间检出的复杂程度增加。     

鲍曼不动杆菌整合子相关耐药基因研究

目的了解我院鲍曼不动杆菌整合子流行情况，证实整合子与鲍曼不动杆菌多重耐药性的关系，建立一种快速简便的整合酶聚合酶链反应（PCR）检测方法。方法收集我院2005年9月至2006年2月临床分离的鲍曼不动杆菌共52株，用纸片扩散法检测鲍曼不动杆菌耐药性及用整合酶PCR检测其整合子基因。结果在52株鲍曼不动杆菌中，整合酶PCR检测出Ⅰ类整合子33株（63％），未检测出Ⅱ类整合子。统计学分析结果显示，整合子阴性和阳性的鲍曼不动杆菌对各种抗生素的耐药率存在明显差异，前者仅对几种抗生素耐药而后者对多种抗生素耐药。结论我院多重耐药鲍曼不动杆菌中主要为Ⅰ类整合子，整合酶PCR是一种快速、简便、易在临床开展的检测方法，同时也是控制医院感染的有效检测手段。     

多重/泛耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学及整合子研究

目的:了解我院临床分离的38株多重/泛耐药鲍曼不动杆菌(MDR-Ab/PDR-Ab)的分子流行病学以及不同来源菌株整合子的携带情况。方法:采用经过MicroScan WalkAway-40全自动微生物分析仪鉴定的38株MDR-Ab/PDR-Ab,应用肠杆菌科基因间重复一致序列(ERIC-PCR)方法分析不动杆菌分子流行特征,并用聚合酶链式反应(PCR)方法对全部菌株的整合酶基因进行扩增。结果:38株MDR-Ab/PDR-Ab在ICU检出率最高,占55.3%;共发现7种克隆基因型,A型检出率最高,为60.5%;整合酶基因阳性菌株占73.7%(28/38)。结论:本地区MDR-Ab/PDR-Ab呈多克隆系并存,而且同一克隆系整合子在进化过程中起到很重要的作用。     

整合子与鲍曼不动杆菌多重耐药机制研究进展

鲍曼不动杆菌是一种不发酵葡萄糖的革兰阴性球杆菌,是重要的条件致病菌,常引起医院内感染。随着临床上广谱抗菌药物的大量应用,出现了多重耐药菌株,该菌引起的院内感染并有逐年上升趋势,给临床抗感染化疗提出了严峻的挑战。整合子-基因盒系统能捕获外来耐药基因,在整合子中形成多种耐药基因的组合和排列,是细菌耐药性播散的机制之一,对细菌基因组的进化具有重要意义。现就整合子-基因盒的结构、表达以及与鲍曼不动抗菌多重耐药的关系进行简要综述。     

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及其与整合子的关系研究

目的 了解临床分离铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药特征;调查金属β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌的流行状况和基因型以及与整合子之间的关系.方法 收集广东省4家三甲医院临床分离的铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验;双纸片协同法和增效法筛选金属β-内酰胺酶表型阳性菌株;设计合成金属β-内酰胺酶和整合子的引物序列进行PCR扩增和测序分析,检测金属β-内酰胺酶基因型并分析其与整合子之间的关系.结果 287株铜绿假单胞菌对11种抗生素的耐药率分别为:亚胺培南(33.80％),美罗培南(33.45％)、头孢他啶(27.87％)、头孢吡肟(36.24％)、庆大霉素(45.30％)、阿米卡星(36.94％)、环丙沙星(33.10％)、左氧氟沙星(37.63％)、氨曲南(47.39％)、哌拉西林(35.19％)、哌拉西林/三唑巴坦(28.57％);多重耐药菌占34.84％(100/287),泛耐药菌株占9.41％(27/287);共有9株铜绿假单胞菌呈金属β-内酰胺酶表型阳性,其中2株产IMP-9型MBL,1株产IMP-25型MBL,4株产VIM-2型MBL;有8株金属β-内酰胺酶表型阳性菌株携带了Ⅰ类整合子,但只有2株成功扩出可变区,其中1株携带了IMP-9基因.结论 铜绿假单胞菌耐药情况严重,本地区铜绿假单胞菌中MBLs的基因型以IMP-9、IMP-25和VIM-2为主;MBLs的基因环境较为复杂,部分MBLs为整合子所携带.     

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶及整合子分布

目的 了解耐亚胺培南鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶及整合子分布情况.方法 收集天津医科大学总医院2008年1月至2010年3月期间,103株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌临床标本.用Vitek-2系统鉴定细菌,并进行药敏试验,通过改良Hodge试验、改良三维试验和2-巯基丙酸协同试验初筛碳青霉烯酶,多重PCR同时检测4种OXA型碳青霉烯酶基因、2种金属酶基因及整合酶基因,对整合子可变区进行PCR检测及序列分析.结果 103株鲍曼不动杆菌中,改良Hodge试验检出碳青霉烯酶阳性75株(72.8%),改良三维试验检出产碳青霉烯酶菌株80株(77.7%),未检出产金属酶菌株.PCR检出blaOXA-51-like+bsaOXA-23-like+int11基因84株,blaOxA-51-like+blaOXA-23-like阳性5株,blaOXA-51-like+intll阳性8株,blaOXA-51-like+blaOXA-24-like阳性2株,仅blaOXA-51-like阳性4株,blaOXA-58-like、金属酶基因(IMP-1、VIM-2)及Ⅱ类整合酶基因(intI2)均阴性.89株(96.7%)Ⅰ类整合酶阳性株均扩增出可变区,检出2种耐药基因盒组合形式:aacA4-catB8-aadAl(2 300 bp)81株,aacCl-orfX-orfX-orfX'-aadAla(3 000 bp)8株.结论 鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药及多重耐药主要与其携带的OXA-23型碳青霉烯酶和Ⅰ类整合子有关.

Abstract：

Objective To investigate the carbapenemases and integrons in imipenem-resistant Acinetobacter baumannii. Methods One hundred and three Acinetobacter baumannii were collected from Janurary 2008 to March 2010 in Tianjin Medical University General Hospital. The identification of strains and antimicrobial susceptibility test were performed by using Vitek-2 compact automatic system. Isolates of imipenem-resistant A. baumannii were screened for carbapenemases by modified Hodge test, improved threedimensional test and 2-mercaptopropionic acid synergy test. Isolates were then subjected to the multiplex PCR targeting genes encoding for OXA type carbapenemases, metallo-β-lactamases (MBLs) and integrases. The variable regions of integrons were amplificated and sequenced. Results Among the 103 isolates, 75 (72. 8% ) demonstrated positive in the modified Hodge test, 80 (77.7%)were positive in the improved three-dimensional test. No MBLs was found in the 2-mercaptopropionic acid synergy test. Eightyfour isolates were positive for blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, and intI1; five were positive for blaOXA-51-like and blaOXA-23-like ;eight were positive for blaOXA-51-like and int11 ;two were positive for blaOXA-51-like and blaOXA-24-like ;four were only found positive for blaOXA-51-like. The blaOXA-58-like, IMP-1, VIM-2 and intI2 genes were all negative. Eighty-nine(96. 7% )of the intI1 positive strains owned the variable region. Two different cassettes arrangements were identified within class 1 integrons:81 isolates harbored aacA4-catB8-aadAI (2 300 bp) and 8 harbored aacCl-orX-orfX-orX'-aadAla (3 000 bp ) . Conclusion The presence of OXA-23 carbapenermase and class Ⅰ integrons are correlated with Acinetobacter baumannii resistant to carbapenems and multi-drug resistance.     

耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌整合子分布与多位点序列分析

目的通过检测临床分离耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌(Carbapenem-resistant enterobacter cloacae,CRECL)整合子,采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)了解其流行特点,为医院控制感染提供依据。方法收集并保存临床CRECL 15株;鉴定与药敏试验采用BD phoenix M50全自动细菌鉴定仪;整合子、可变区、MLST和碳青霉烯酶测定采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)和琼脂糖凝胶电泳,并对可变区阳性、七对管家基因和碳青霉烯酶的菌株DNA测序,所得数据与数据库比对分析。结果 15株CRECLⅠ类整合子阳性检出率80.0%(12/15),未检出II类及III类整合子;全部CRECL菌株均扩增出可变区,其中11株检测出耐药基因盒,分别为aacA 4-cr、blaOXA30、CatB 3、ARR-3、QacEdelta 1共5种;15株CRECL菌株检出5种序列分型(ST),其中11株为ST 93型,其余为ST 167型、ST 1108型、ST 136型、ST 4型;12株菌株检测出新德里金属-β-内酰胺酶1基因(NDM-1)。结论Ⅰ类整合子与阴沟肠杆菌耐药存在相关性,可能在耐药基因传播中起重要作用;医院CRECL整合子阳性菌株检出率较高;ST型主要为ST 93型,整合子阳性菌株及NDM-1与ST型有较好一致性。     

Low antibiotic resistance rates and high genetic heterogeneity of Escherichia coli isolates from urinary tract infections of diabetic patients in Tunisia

Antimicrobial resistance phenotypes, tetracycline, sulphonamide resistance genes, and integrons were analysed in 48 Escherichia coli isolates recovered from urine cultures of diabetic patients in Tunisia. Twenty-one were susceptible to all antibiotics tested. High rates of resistance were observed for amoxicillin (39.5%), trimethoprim-sulphamethoxazole (33.3%), sulphonamide (33.3%), and tetracycline (31.2%). Resistance to imipenem was not detected, and ESBL producing isolates were not recovered. Our analysis assigned 26, 13, 3, and 5 isolates to phylogroups A, B1, B2, and D, respectively. It is worthy to note that all the resistant isolates belonged to phylogroups A (15 isolates) and B1 (12 isolates), while for the 21 susceptible isolates, phylogroups A, B1, B2, and D were found in 11, 2, 3, and 5 isolates, respectively. Among 15 tetracycline-resistant isolates, the tetA and tetB genes were detected in three and four isolates, respectively. Among 17 sulphonamide resistant isolates, 12, 3, and 1 isolates harboured sul1, sul2, and sul3, respectively. sul1 and sul2 genes occurred simultaneously in three isolates. Integrons were detected in 11 isolates. Ten isolates harboured the class 1 integron and three the class 2 integron. The variable regions (VRs) of the class 1 integrons were analysed in the 10 in1-positive isolates, and the following gene cassette arrangements were detected: dfrA12-orfF-aadA2-cmIA1-aadA1-qacH-IS440-sul3 (one isolate), dfrA15-aadA1 (three isolates), dfrA5 (one isolate), dfrA17- aadA5 (one isolate), dfrA1-aadA1 (one isolate), and dfrA14 (one isolate). The VR of class 2 integron was analysed in the in2-positive isolates, and only one gene cassette arrangement was detected, dfrA1-sat-aadA1. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis of resistant isolates showed that all were unrelated. Our results highlight the moderate antibiotic resistance in the clinical isolates as well as their heterogeneous genetic background.