蛇足石杉内生真菌2F09P03B产石杉碱甲发酵条件的研究

 目的 研究发酵条件对蛇足石杉支顶孢属内生真菌2F09P03B 石杉碱甲生成的影响，并探讨发酵条件的优化。 方法 通过测定 2F09P03B 生长曲线、石杉碱甲积累曲线和培养液 pH 值随时间的变化情况，了解该菌株的培养特性；考察不同碳源和氮源对石杉碱甲积累的影响。在单因素试验的基础上，利用正交试验优化培养基碳源、氮源组成；考察 MgSO4、KH2PO4、NaCl、CaSO4 对石杉碱甲生成的影响，确定无机盐组成；优化接种量、发酵时间、培养温度、摇床转速等发酵工艺条件。 结果 菌株 2F09P03B 的最佳培养基组成为：马铃薯 150 g/L，玉米粉 30 g/L，麦芽糖 25 g/L，酵母膏 10 g/L，麸皮 30 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 0.3 g/L，CaSO4 0.3 g/L，pH 自然；最佳发酵工艺条件为：接种量 8%，发酵时间 10 d，培养温度 28 ℃，摇床转数 140 r/min。在此条件下，发酵液中石杉碱甲含量为 8.17 μg/L，最高达到 8.32 μg/L，约为其干重的 0.07% 左右。 结论 发酵条件对菌株 2F09P03B 石杉碱甲产量有明显影响。优化后的发酵条件可使该菌株石杉碱甲产量明显提高，有望成为石杉碱甲新药源。     

千层塔内生真菌分离鉴定的初步研究

目的从治疗老年痴呆药用植物千层塔中分离内生真菌，并进行初步鉴定。方法用PDA平板培养基分离菌株，对照真菌鉴定手册，根据菌株的菌落形态、大小、颜色、生长速率、质地、生长培养基颜色变化以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定。结果从千层塔的茎中分离出4株内生真菌，分别属于顶孢霉属、单轴霉属、酵母和青霉属。结论首次从千层塔中分离和鉴定出4株内生真菌。     

高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体

目的从千层塔植物提取物中分离制备石杉碱甲单体。方法利用高速逆流色谱技术,通过寻找合适的两相溶剂体系及工艺参数,研究及讨论石杉碱甲分离制备的新方法。结果以n-Hexane/n-BuOH/H2O(4∶1∶5,V/V/V)为两相溶剂体系,在优化的工艺参数条件下,利用高速逆流色谱技术,获得了单体纯度为98.6%(HPLC)的石杉碱甲单体。结论利用高速逆流色谱技术成功地从千层塔植物提取物中分离制备了纯度高于98%的石杉碱甲单体。     

石杉碱甲药源植物研究进展

石杉碱甲（Huperzine A）从石杉科（Huperziaceae）石杉属（Huperzia）植物蛇足石杉（Huperzia serrfta（Thunb．ex Murray）Trev．）中分离得到,其临床治疗阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）疗效显著。由于石杉碱甲的化学合成在短时间内难以克服合成步骤繁琐、成本高、活性低等特点,自然资源的挖掘和开发成为解决石杉碱甲短缺的有效途径之一。故对近年来石杉碱甲药源植物研究所取的成果和难点进行总结,以期为今后的研究提供一定参考。     

蛇足石杉化学成分和药理作用研究进展

结合国内外文献综述蛇足石杉生物碱和三萜化学成分和药理作用,尤其重点归纳蛇足石杉石松生物碱的结构、类型。石杉碱甲为高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,优于国外已上市的老年痴呆症治疗药物,是首先从蛇足石杉中发现的lycodine生物碱类型,从蛇足石杉分离的该类型其他生物碱也具有较强的类似活性,具备进一步研究与开发的潜力。     

龙骨马尾杉环阿屯醇合成酶(HcCAS1)基因的 克隆和生物信息学分析

目的:对大伸筋草的原植物龙骨马尾杉Huperzia carinata环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因HcCAS编码区进行克隆及序列分析。方法:根据本实验室已报道的龙骨马尾杉转录组高通量测序结果分析获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的CAS基因序列,采用RT-PCR技术,以龙骨马尾杉根、茎、叶混合样品总RNA为模板克隆得到龙骨马尾杉HcCAS基因的编码区序列,并对HcCAS蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。结果:序列分析表明,所克隆的HcCAS基因编码区开放阅读框(open reading frame,ORF)长为2 274 bp,编码757个氨基酸残基,命名为HcCAS1(GenBank登陆号JN790125)。结论:该研究在国内外首次获得龙骨马尾杉HcCAS基因的编码区序列,为进一步研究HcCAS蛋白在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及酶活性位点的鉴定奠定基础。     

蛇足石杉内生真菌Penicillium chrysogenum MT-12中2个新二苯醚类成分

目的研究蛇足石杉内生真菌Penicillium chrysogenum MT-12经固体发酵培养后的代谢产物。方法利用硅胶、Sephadex LH-20及半制备液相色谱等方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质及IR、MS、NMR等光谱数据鉴定化合物的结构;利用体外模型进行抗炎、乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选。结果从P.chrysogenum MT-12固体发酵培养后的代谢产物中共分离鉴定8个二苯醚类化合物,分别为黄青霉内酯A(1)、黄青霉内酯B(2)、talaromyone A(3)、isopenicillide(4)、penicillide(5)、hydroxypenicillide(6)、purpactin A(7)、黄青霉内酯C(8)。结论化合物1、2为新化合物,化合物3为首次从青霉属中分离得到,化合物4~8为首次从产黄青霉菌中分离得到;化合物1、2对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生有一定抑制活性,半数抑制浓度(IC50)值分别为(72.6±2.3)、(41.2±1.4)μmol/L,而所有化合物在100μmol/L时对乙酰胆碱酯酶不显示抑制活性。     

蛇足石杉离体培养产石杉碱甲的条件优化及动力学研究

目的以具有产石杉碱甲能力的蛇足石杉离体叶状体为研究对象,探究蛇足石杉离体培养物累积石杉碱甲的影响因素及生产动态变化规律。方法应用正交设计对蛇足石杉离体培养叶状体的植物生长物质浓度进行筛选,采用HPLC法对叶状体提取物中的目标成分进行定性定量检测,用Logistic模型拟合叶状体的生长曲线。结果以白光为主要光源,光照时间为12 h/d,1/4 MS固体培养基,为蛇足石杉叶状体产石杉碱甲的最佳条件,相对增殖率达到3 174.5%,石杉碱甲累积量为72.45μg/L;蛇足石杉离体叶状体增殖的生长曲线呈"S"形,继代周期以50 d左右为最适;60 d后生长进入稳定阶段,累积石杉碱甲量明显加快,直至85 d达到最大值7.453μg/g,即叶状体先快速增殖,后累积石杉碱甲。结论叶状体累积石杉碱甲与叶状体增殖呈非生长偶联型,叶状体增长规律符合Logistic生长模型,最大的比生长速率(μmax)为0.071·d-1。     

4种石杉科植物中产生石杉碱甲的内生真菌的分离及初步鉴定和HPLC测定石杉碱甲的含量

目的 从4种石杉科植物中得到产生石杉碱甲（Huperzine A）的内生真菌,改进筛选内生真菌的培养条件。方法 消毒后的材料在培养基上培养和分离其内生真菌,HPLC检测代谢产物,显微形态鉴定菌种。结果 从蛇足石杉,长柄石杉,伏贴石杉,柳杉叶马尾杉中分离得到32株内生真菌,其中从柳杉叶马尾杉分离出的2株内生真菌能够产生石杉碱甲,分别是HA15.（芽胞菌属）和HA23.（葡萄孢属）。结论 首次从柳杉叶马尾杉中分离出能产生石杉碱甲的内生真菌。     

千层塔中三萜成分的研究

前曾报道自千层塔[Huperzia serrata Thunb.(Trev)=Lycopodium serratum Thunb(Trev.)]中分得具有胆碱酯酶抑制活性的新生物碱——石杉碱甲、石杉碱乙、甲基石杉碱乙及已知生物碱8-deoxyserratinine,serratinine,lycodoline及lycoclavine。为进一步阐明该植物的化学成分,我们对其三萜成分进行了研究。从浙江安吉产的千层塔植物中分到六个石松三萜,其中一个为新化合物,经下述方法推定为serratenediol-21-acetate(Ⅰ)。另五