肝内乙肝病毒cccDNA的研究进展

肝内HBVcccDNA被认为在乙肝病毒持续感染中是停药反跳和病毒耐药的关键因素.本文就肝内HBVcccDNA的产生、属性、检测方法、清除机制,及与现有抗病毒治疗的关系,作了综述.期望为终结乙肝病毒持续感染提供一些理论基础.     

HBVcccDNA检测判断拉米夫定抗乙肝病毒治疗的预后

目的评价外用血PBMC中HBVcccDNA检测判断乙肝抗病毒治疗的预后。方法采用MEIA法、PCR-微流芯片法检测25例抗病毒治疗的慢性肝病患者和与之匹配的65例未抗病毒治疗慢性肝病患者血清HBVM、HBVDNA、外周血PBMC中HBVcccDNA。结果43．3％（39／90）的慢性肝痛患者HBVcccDNA阳性;抗病毒治疗的慢性肝病患者HBVcccDNA阳性率20．0％（5／25）显著低于未抗病毒治疗者52．3％（34／65）,P〈0．01,尤其在HBVDNA〈103copy／ml的慢性肝病患者中0（0／15）、31．3％（5／16）,P〈0．05。无论HBeAg＋／HBeAb-还是HBeAg-／HBeAb＋,抗病毒治疗者HBVcccDNA阳性率均显著低于未抗病毒治疗者（P〈0．01、P〈0．05）。结论慢性乙型肝病患者HB—VDNA高浓度、HBeAg＋／HBeAb-者HBVcccDNA检出率高;外周血PBMC中HBVcccDNA与血清HBVDNA、HBVM联合检测能提高抗病毒治疗效果判断的缝确性．     

水芹总酚酸对2.2.15细胞HBV DNA、cccDNA的抑制作用

目的 观察水芹总酚酸对2.2.15细胞HBV-DNA、cccDNA的抑制作用.方法 药物稀释成500、250、125 mg·L-1加入2.2.15细胞进行培养,每4 d换含同浓度药物培养液;分别收集d 4、8以及停药后4 d的细胞,试剂盒提取HBV-DNA、cccDNA,荧光定量PCR(FQ-PCR)测定其含量,观察水芹总酚酸对其抑制作用.结果 水芹总酚酸对HBV-DNA和cccDNA都具有很好的抑制作用,在细胞培养的d 8其高、中剂量(500、250 mg·L-1)的抑制作用达到最大: HBV-DNA为62.3%和47.7%,cccDNA为62.7%和61.3%,且在停药后3 d仍保持较高的抑制率(P<0.05).结论 水芹总酚酸可以有效的抑制2.2.15细胞HBV-DNA、cccDNA的表达,抗病毒作用明显,且无明显的停药反跳现象.     

乙型肝炎病毒cccDNA巢式-实时荧光定量PCR法的建立及应用

目的建立检测HBV共价闭合环状（cccDNA）的巢式-荧光定量PCR法,检测外周血单核细胞（PBMC）及骨髓单核细胞（MMNC）中cccDNA。方法根据HBV cccDNA与松弛结构DNA（rcDNA）结构上的差异,设计2对跨缺口的特异性引物及下游的特异性TaqMan探针。根据Mung Bean Nuclease对rcDNA与cccDNA作用的不同,使cccDNA扩增而使rcDNA降解,分别用外引物及内引物进行PCR反应,再用荧光探针进行实时荧光定量PCR,根据阳性参照物,计算出检测标本定量值。结果成功建立了HBV cccDNA巢式-荧光定量PCR的检测方法,线性范围为5.0×102～3.9×107拷贝/ml。用上述方法检测25例慢性乙型肝炎（CHB）及肝硬化血清HBV DNA阳性患者PBMC中cccDNA,7例MMNC中cccDNA,21例健康献血者PBMC cccDNA,骨髓标本中有3例cccDNA阳性,25例外周血标本中有9例cccDNA阳性。结论巢式-荧光定量PCR法可检测乙型肝炎患者PBMC及MMNC中的HBV cccDNA含量。PBMC及MMNC中可检测到HBV cccDNA。     

肝组织HBVcccDNA定量检测在慢性乙型肝炎诊断及治疗中的作用

目的探讨肝组织HBVcccDNA定量在慢性乙型肝炎（CHB）诊断和治疗中的意义。方法使用荧光PCR检测仪,对85例CHB患者肝组织HBVcccDNA行定量检测,同时行肝组织及血清HBV-DNA定量检测。结果①85例CHB患者肝组织均检测到HBVcccDNA;②肝组织HBVcccDNA定量与肝组织HBV．DNA定量呈高度相关,与血清HBV-DNA定量亦呈正相关;③45例HBeAg阳性CHB患者应用拉米夫定治疗48周后,肝组织HBVcccDNA仍可维持一定水平（特别是血清HBV-DNA定量低于检测水平以下者）。结论肝组织HBVcccDNA定量检测,是评价HBV复制、感染持续、临床药物抗HBV疗效的可靠指标。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBVcccDNA的相关性

目的：通过对慢性乙型肝炎患者肝组织及外周血单个核细胞（PBMC）中乙肝病毒共价闭合环状DNA（HBVcccDNA）的特异性定量检测,探讨两者的相关性和临床可行性。方法：取本院慢性乙型肝炎患者肝组织穿刺标本20份,在肝穿刺当天抽取患者外周抗凝血5mL,标本经相应处理后行HBVcccDNA检测。结果：20份慢性乙型肝炎患者肝组织标本中有18份HBVcccDNA检测为阳性,最大值为5．61×10^5copy／μg,最小值为3．26×10^3copy／μg,平均为1．79×10^4copy／μg。20份血浆中PBMC中HBVcccDNA检测均为阴性。结论：在慢性乙型肝炎患者肝纽织中可检测到HBVcccDNA,但未能在PBMC中检测到HBVcccDNA,因此PBMC不能支持HBV的复制。     

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目的探讨儿童慢性乙型肝炎T细胞亚群与病毒复制水平、肝功能及肝组织病理之间的关系。方法甘肃省人民医院儿科和兰州大学第一医院感染科按门诊和住院就诊的先后顺序选择慢性乙型肝炎病毒(HBV)-DNA阳性124例中乙型肝炎患儿,其中男84例,女40例。124例中HBV携带者65例、慢性乙肝59例(轻度31例、中度18例、重度10例),对患儿均进行外周血T细胞亚群、cccDNA、DNA、乙肝病毒标志物、肝功检测,对其中的46例行肝组织病理学检测。同时以60例HBsAg(-)患儿作为正常对照组。结果各组乙肝患儿外周血CD3+,CD4+及CD4+/CD8+明显低于正常对照组(F值分别为13.26、12.34、14.73,P均<0.01),CD8+高于正常对照组(F=-11.87,P<0.01),携带者组和轻度组CD3+,CD4+及CD4+/CD8+明显低于中度组和重度组差,异有统计学意义;中、重度慢性乙肝患儿HBVcccDNA阳性率,高于携带者和轻度组(F=25.429,P<0.01);HBVcccDNA阳性组及HBeAg(+)组分别与HBVcccDNA阴性组及HBeAg(-)组比较,CD3+,CD4+,CD4+/CD8+均减低,CD8+均细胞增高,均有统计学意义,CD8+随病毒载量升高而增加(F=-11.43,P<0.01),CD3+,CD4+,CD4+/CD8+随其增加而降低(F值分别为12.42、13.87、12.75,P均<0.01);转氨酶异常组和转氨酶正常组比较,CD3+、CD4+、CD4+/CD8+下降(t值分别为15.28、14.63、27.74,P均<0.01),CD8+细胞增高(t=-16.39,P<0.01),有统计学意义;CD3+、CD4+、CD4+/CD8+随炎性和纤维化程度加重有升高趋势(t值分别为9.25、11.85、26.34,P均<0.01),CD8+随炎性和纤维化程度加重呈下降趋势(t=-10.18,P<0.01)。结论 T细胞免疫功能紊乱与病毒复制水平、肝功能及肝组织病理有一定关系,HBV活跃复制加重免疫功能紊乱,免疫功能的恢复,一方面可清除病毒,一方面引起肝组织病理改变。     

慢性乙型肝病患者外周血单个核细胞以及血清中HBVcccDNA的对照检测

目的评价慢性乙型肝病患者外周血中HBVcccDNA存在状态及临床意义。方法采用微粒子酶免分析法（MEIA）、荧光聚合酶链反应（PCR）法、PCR-微流芯片法检测17例慢性乙型肝炎患者、12例终末期肝病肝移植术后患者血清HBVM、HBVDNA、HBVcccDNA、外周血单个核细胞（PBMC）中HBVcccDNA。结果17例慢性乙型肝病患者、12例肝移植患者外周血血清、白细胞中HBVcccDNA检出率分别为10／17、7／17和1／12、8／12,血清HBVDNA检出率分别为12／17、0／12。结论血清HBVcccDNA的来源可能不只是肝组织;慢性乙型肝病患者外周血PBMC中HBVcccDNA低于血清HBVcccDNA及HBV DNA,HBVcccDNA、HBV DNA二者联合检测更能准确判断病毒复制;肝移植术后血清病毒复制不活跃,外周血低滴度HBVcccDNA的存在可能为乙型肝炎的复发提供了基础。     

定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的临床意义

在感染乙型肝炎病毒(HBV)的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA-共价闭合环状DNA(covalentlyclosed circular DNA,cccDNA).cccDNA是乙肝病毒基因组的复制中间体,是病毒mRNA和前基因组RNA转录的模板,它的存在是病毒复制的一个重要指标.应用荧光定量PCR方法检测慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA水平,同时检测肝组织、血清HBV DNA,肝细胞HBcAg表达及肝功能等,以探讨HBV cccDNA与病毒复制、肝实质损害的关系及在抗病毒治疗中的意义,为确定抗病毒治疗的最佳方案、治疗终点等提供理论依据.     

不同荧光定量PCR对于HBVcccDNA水平的检测差异对比

目的：研究对比不同荧光定量聚合酶链反应PCR对于乙型肝炎病毒HBVcccDNA水平的检测差异。方法选择20例从2007—2008年在广州市第八人民医院接受住院治疗的乙肝患者作为研究对象。提取其血清及肝组织进行实验分析,另取2份不含HBV感染的患者血清和肝组织作阴性对照组。将其中经或未经脱氧核糖核酸酶DNase处理的样本分别使用HBVc-ccDNA跨单缺口PCR和跨双缺口PCR检测。分析TaqMan探针跨单缺口PCR测定HBVcccDNA的结果,对比跨单、双缺口PCR测定结果以及不同荧光定量PCR的测定结果。分析血清和肝组织中HBVDNA与HBVcccDNA病毒载量的关系。结果血清及肝组织经过DNase消化后的有关拷贝数显著低于未消化者。血清和肝组织跨双缺口PCR测定结果较跨单缺口PCR测定结果均显著降低。血清中的HBVDNA及cccDNA实验结果均显著低于在肝组织中的测定结果,差异均有统计学意义（均P＜0．05）。阴性对照组经四种荧光定量PCR检测后均呈阴性。20例E抗原呈阳性的乙肝病人,其机体病毒载量总体趋势为血清HBVDNA的载量较肝组织更低,差异显著。结论 DNase 可有效减少 HBVcccDNA 在检测过程中的假阳性情况,经DNase处理后的跨双缺口PCR检测特异性最高。同时,血清中基本不含cccDNA。