抗辐射菌DNA结合蛋白的氨基酸序列分析

目的　对抗辐射菌Ｄ．ｒａｄｉｏｕｄｕｒａｎｓ 的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ） 进行Ｎ－ 末端氨基酸（ＡＡ） 序列分析,探讨其抗辐射分子学组成的特性。方法　采用地高辛（ＤＩＧ） 标记染色体ＤＮＡ 作为探针,ＳｏｕｔｈＷｅｓｔｅｒｎ 印迹法检测ＤＢＰ,在Ｎ－ 端ＡＡ 自动序列仪上分析ＡＡ序列。结果　野生型抗辐射菌存有８ 种ＤＢＰ的特性蛋白（分子量分别为１２２、９３、３３、２９、１６、１５、１４ 和１２ｋｄ）;ＡＡ 序列分析发现其中９３ｋｄ 和３３ｋｄ 可能为新的蛋白质;两种新ＤＢＰ 的表达水平随不同培养基和培养时间而变化。结论　抗辐射菌的ＤＢＰ,尤其是９３ｋｄ 和３３ｋｄ 的ＤＢＰ与其辐射耐受性可能有密切关系     

耐辐射奇球菌抗辐射小分子化合物研究进展

耐辐射奇球菌作为世界上“抗性最强”的细菌,能够在强辐射、严寒、干旱和酸性环境中继续生存.耐辐射奇球菌之所以对射线及干旱等恶劣环境有较强的抗性,与其自身的生物学结构及功能有关,相关研究报道了其超强的DNA损失修复机制以及蛋白质损伤修复及清除能力.早期研究发现类胡萝卜素是其抗辐射、抗紫外线作用的一种小分子,近期发现锰离子络合物在其抗辐射作用中发挥了重要作用.该文将对耐辐射奇球菌中与抗辐射有关的小分子物质进行综述,以期为开发抗辐射、抗氧化先导化合物提供思路.     

耐辐射奇球菌PprI蛋白质在毕赤酵母菌中的高效表达及纯化

目的 利用真核毕赤酵母高效表达原核的耐辐射奇球菌pprI基因,建立高效表达及纯化PprI蛋白质的技术路线。方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,改造耐辐射奇球菌pprI基因的编码序列,利用PCR技术全合成改造过的pprI基因,并在其N末端添加一个6×His标签。PCR产物经纯化后克隆到毕赤酵母表达载体pHBM-905A中,利用Cop I和Not I双酶切并回收线性化的目的片段后,转化毕赤酵母GS115菌株。将获得的毕赤酵母转化子诱导表达,SDS-PAGE、Western blot和质谱检测培养上清液,用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,BCA法测定蛋白浓度。结果 新合成的耐辐射奇球菌pprI基因编码序列正确,毕赤酵母转化菌株的培养上清液经SDS-PAGE和Western blot均可检测到相对分子质量为43000的目的蛋白条带,经质谱检测证实该目的蛋白为耐辐射奇球菌PprI蛋白。选用Ni-NTA柱获得了大量纯化的PprI蛋白,应用浓度为250 mmol/L的咪唑淋洗时,PprI蛋白洗脱率最高。BCA法测得纯化蛋白浓度为0.35 mg/ml。结论 建立了一种新的适于毕赤酵母表达的耐辐射奇球菌pprI基因,成功构建了分泌表达PprI蛋白质的重组毕赤酵母工程菌株,建立了高效表达目的蛋白的技术路线,并获得了高效表达和纯化的PprI蛋白。     

Lovastatin causes sensitization of HeLa cells to ionizing radiation‐induced apoptosis by the abrogation of G2 blockage

Purpose: To investigate the effect of inhibition of Ras/Rho‐regulated signalling by 3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl coenzyme A (HMG‐CoA) reductase inhibitors (statins) on radiation‐induced cell killing and apoptosis.

Materials and methods: Different human cell lines were pretreated or not with lovastatin before exposure to γ‐rays. Afterwards, radiation‐induced cell killing, formation and repair of double‐strand breaks, activation of radiation‐inducible signal mechanisms (i.e. p53, p21, extracellular‐signal‐related kinase (ERK), NF‐κB), changes in cell cycle progression and apoptosis were analysed.

Results: As shown by a colony formation assay, lovastatin sensitized HeLa cells to γ‐radiation‐induced cell killing. The lovastatin effect was cell‐type specific. Neither the level of γ‐ray‐induced double‐strand breaks nor its repair were affected by lovastatin. Sensitization was independent of p53/p21^Waf1‐ and NF‐κB‐related mechanisms. Radiation‐stimulated activation of ERKs was attenuated by lovastatin. Cell cycle analyses revealed that the level of γ‐ray‐induced G2 blockage was not affected by lovastatin. However, as analysed up to 72?h after irradiation, lovastatin pretreated cells showed an accelerated abrogation of G2 blockage as compared with the control. G2 abrogation is paralleled by an increase in the frequency of apoptotic and necrotic cells.

Conclusions: The data show that lovastatin can render human cells more sensitive to the cytotoxic effect of γ‐rays. This is related to abrogation of G2 blockage and a concomitant increase in apoptotic/necrotic cell death.     

封面

目的探讨耐辐射奇球菌(DR)pprI基因对丝裂霉素C(MMC)诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及机制。 方法细胞分为空白对照组(不干预)、未转染组(MMC处理)、空质粒转染组(pCMV-C-Flag+MMC)与pprI基因转染组(pCMV-C-Flag-pprI+MMC)。CCK-8、抗氧化酶相关试剂盒、TUNEL、JC-1荧光探针和qRT-PCR测定细胞存活率、氧化应激、细胞凋亡率、线粒体损伤、凋亡途径相关基因mRNA的表达。 结果与空白对照组比较,未转染组细胞存活率、线粒体膜电位、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)mRNA表达下降;氧化应激反应、细胞凋亡率及Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、Caspase-3、多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)mRNA表达增加(P＜0.05)。与未转染组比较,pprI基因转染组细胞存活率、线粒体膜电位、Bcl-2 mRNA表达增加;氧化应激反应、细胞凋亡率及Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP mRNA表达下降(P＜0.05)。 结论耐辐射奇球菌pprI基因对丝裂霉素C诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用,其机制可能与激活线粒体凋亡途径有关。     

耐辐射菌的辐射抗性与其核内DNA结合蛋白相关性研究

本文采用地高辛（ＤＩＧ）标记染色体ＤＮＡ作为探针,Ｓｏｕｔｈ－Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）,对耐辐射菌Ｄ．Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ的ＤＢＰ进行Ｎ－末端氨基酸序列分析。研究结果表明：在野生型耐辐射菌中存有八种ＤＢＰ的特征蛋白（它们的分子量分别为１２２,９３,２９,１６,１５,１４和１２ｋＤａ）;经氨基酸序列分析发现其中９３ｋＤａ和３３ｋＤａ可能为新的蛋白质;这两种新ＤＢＰ的表达水平     

耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

目的 构建耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株, 为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础。 方法 设计并合成HA-pprM基因(HA为流感病毒血凝素)全长的引物, 以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板, PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长, 经NdeⅠ酶切后, 与pRADK载体连接并转化大肠杆菌, 经培养、提取质粒及纯化后, 采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性; 采用CaCl₂法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中, 通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。 结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小(438 bp), 测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致, Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13000。 结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM, 为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础。     

耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达

目的扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础。方法以无任何突变的pGEX-6p-1-pprM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的Luria-Bertani（LB）固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定。通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达。裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达。结果菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功。荧光拍照结果显示,pEGFP-C1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×103处有融合蛋白表达。结论笔者成功将所构pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础。     

耐辐射奇球菌中多效蛋白PprA功能的研究进展

耐辐射奇球菌(DR)是研究辐射抗性的模式生物,PprA蛋白(pleiotropic protein promoting DNA repair)是DR中一种特有的、促进DNA修复的多效蛋白.笔者对PprA蛋白在DNA损伤修复和维持基因组稳定性等方面的功能进行了综述,另通过运用生物信息学方法预测其结构域及与PprA蛋白相互作用的蛋白,进一步了解其发挥作用的机制和途径.