筛选细菌致病基因的几种常用方法

以致病基因作为靶点的药物为我们提供了从基因水平预防、治疗疾病的可能,筛选致病基因,成为攻克细菌、病毒乃至遗传因素导致的疾病的一个重要课题。筛选方法不断地改革与创新,针对不同的研究目的需要合理地选择筛选方法,本文简要介绍几种常用的细菌致病基因的筛选方法。     

小鼠增龄相关性胸腺基因的克隆

目的：用基因差异显示技术研究小鼠胸腺增龄相关基因。方法：利用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异显示的表达序列标签（ESTs)。选其1个1月龄高表达的EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中筛选出一个827bp的阳性克隆,并用PCR扩增延长为1406bp的cDNA片段（mt22-1406)。结果：同源性分析结果表明,mt22-1406含一编码438A的开放阅读框,与人延伸因子1γ（EF1γ）高度同源,其Genbank接收号为BE241062。结论：获得一个含完整开放阅读框与小鼠胸腺增龄相关的基因。     

DDRT法筛选抗肿瘤海洋微生物

海洋微生物药物资源是近年来寻找新药的研究热点。本文先采用 MTT法对近千株的海洋放线菌、细菌、霉及极地和大洋细菌进行细胞毒活性的筛选。结果得到约有 10 %的放线菌、1株极地细菌及 2株霉具有细胞毒活性 ,共 4 9株。利用 DNA修复特性在 E.coli343/ 5 91和 E.coli343/ 6 36之间的差异性 ,采用DDRT法对初筛得到的具细胞毒性菌株进行 DNA损伤的筛选 ,得到 3株活性菌株 ,AK- 17是其中之一。裸小鼠试验结果提示其具有抗肿瘤作用。采用 FCM进行细胞周期的分析 ,表明经 AK- 17处理后 ,其可对 MGC-80 3肿瘤细胞在 G2 / M期产生轻微的阻滞作用 ,当处理时间增长后 ,部分细胞发生凋亡。     

C6／36细胞感染登革Ⅱ型病毒后基因表达的变化

本研究在C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒24h后,用DDRT-PCR对细胞基因表达的变化进行了研究,并对其中2条表达有变化的基因进行了序列分析,1条为感染后表达量增加的基因片段,1条为感染后表达量减少的基因片段,通过GenBank查询尚未发现同源序列.这一发现对于阐明登革病毒和其宿主细胞之间的关系,探讨病毒感染的细胞内机制有积极的意义.     

利用荧光mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs

目的:获取短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs.方法:应用荧光mRNA差异显示技术进行筛选,并利用反向Northern杂交方法对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性.结果:共获得32个与盐胁迫相关的cDNA序列,并获得GenBank 注册号.BLAST同源性分析结果表明,13个与已知基因序列有同源性,19个为未知ESTs.其类型分别为:诱导表达型,22个;增强表达型,7个;抑制表达型,3个.结论:通过荧光mRNA差异显示技术获得了短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs,对它们的进一步研究将为短芒大麦耐盐分子机制的发现提供思路.     

差别显示法研究海绵状血管瘤的形成机制

目的　初步探讨人海绵状血管瘤的形成机制。方法　收集 16例经病理证实的海绵状血管瘤组织标本 ,及 10例正常大隐静脉标本。采用DDRT PCR方法分析人海绵状血管瘤和人正常静脉基因表达的差异。结果　人海绵状血管瘤在 70 0bp左右cDNA相对应的mRNA表达明显减少 (P <0 .0 5 )。结论　该基因可能对血管形成具有抑制作用 ,缺乏该基因的表达可能是人海绵状血管瘤形成的重要发病机制     

大鼠睾丸精子发生中差异表达基因RSD5的克隆与表达分析

为了分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机理,本文以大鼠睾丸曲线精管显微分离结合DDRT－PCR的方法,所得的不同区段中差异表达的EST（expressed sequence tag)筛选大鼠睾丸cDNA文库,获得一个新的cDNA序列－RSD5。RSD5 cDNA全长1556bp,编码176个氨基酸,GenBank接收号为ASF146738。RSDS基因编码蛋白序列含有一个PEST基序,这是蛋白质快速降解的标志。Northern blot分析结果显示,RSD5在睾丸组织和脑组织表达量较高,且在不同发育天龄的睾丸组织中具有显著的表达差异性。RSD5基因的表达特征及其编码蛋白的PEST基序提示RSD5蛋白可能在精子发生中具有重要作用。     

小鼠轻型肠型放射病肠上皮细胞差异表达基因的筛选研究

目的 筛选经辐射诱导后小鼠肠上皮细胞的差异或特异表达基因。方法 通过基因库检索和计算机分析，设计出较通用的5’端武断引物在基因库中其呈现几率要高出数倍到数十倍的4条5′端高同源mRNA差示引物，应用DDRT-PCR，测序凝胶电泳，放射自显影，分子杂交等方法，分析并筛选小鼠受12Gyγ射线全身照射后3h(R1组）和96h(R2组）肠上皮细胞差异或特异表达基因。结果 5′端高同源性引物mRNA差异结果显示，与正常比较，小鼠全身12Gy照射后不同时相的肠上皮细胞基因表达存在差异，从近8000条PCR扩增产物中，比较筛选出12个差异表达基因片段，RNA-blot杂交对11个辐射损伤情况下差异表达基因片段进行了鉴定，R1S1和R1S2差异基因片段在辐射损伤后3h的肠上皮细胞中呈特异性表达；R2S2和R2S5基因片段在辐射损伤后96h的肠上皮细胞中呈特异性表达，R2S1，R2S6和R2S8基因片段是假阳性差异表达基因片段；而R2S1，R2S4及R2S8用RNA-blot法检测不到表达，序列分析结果显示R1S1和R2S2在基因库中未见高同源的基因序列，与R1S1同源性最高（60.00%)的是一个源于大鼠输卵管特异性糖蛋白基因，R2S5与一种小鼠肌细胞钙离子信号传导分子有67.21%的同源性；R2S2高度同源于鼠源性肿瘤诱导蛋白p32(91.52%)；R1S2在基因库中未检测到同源基因，结论 证实高同源引物具有良好的代表性和呈现几率，并筛选和鉴定出与辐射诱导的肠上皮损伤和修复相关的一组差异或特异表达基因。