人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3．1—parkin，将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA，用RT—PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA，插入pCR2．1—TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pCD—NA3．1，利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，采用RT—PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT—PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体，获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆，为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

本刊被国际检索系统美国《化学文摘》收录

背景与目 的光动力学疗法（PDT）是对化疗和放疗已产生耐药的肿瘤的一种替代疗法。该方法主要通过激光照射光敏剂产生活性氧，继而杀死肿瘤细胞。有研究表明抑癌蛋白P53能使人类某些肿瘤细胞对PDT治疗更加敏感。但是，目前仍然没有直接的证据来证明这一观点。本研究旨在探讨肿瘤细胞中原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ）和野生型P53蛋白的相互作用，及PpⅨ和PpⅨ—PDT诱导人结肠癌细胞发生死亡与P53蛋白的相关性。     

正常及突变MyBPC与肌凝蛋白结合功能的对比研究

目的　比较正常及突变 My BPC与肌凝蛋白的结合功能 .方法　重叠 PCR法制备正常及突变 My BPC的表达载体 ,大肠杆菌 BL- 2 1中表达并提纯蛋白 . 10 0 μL 含 2 .2 μmol· L- 1肌凝蛋白溶液中 ,分别加入不同浓度 My BPC蛋白 ,经离心、 SDS- PAGE,密度法测定两者的结合率 .结果　3774D1 8,32 2 3S1 4 0 结合率分别为 (6 8.2 0± 1.72 ) % ,(2 4.41±2 .10 ) % ,较正常 My BPC (82 .70± 2 .44 ) %显著降低 (n=5 ,P<0 .0 1) .结论　为家族性肥厚型心肌病突变基因的“肽类毒剂”致病学说提供了依据     

磁性阳离子高分子脂质体结合野生型p53投递系统的构建

目的用合成的磁性阳离子高分子脂质体与野生型p53(WTp53)基因质粒结合,构建靶向纳米载体投递系统,为进一步行静脉内皮细胞转染奠定基础。方法应用大肠杆菌重组质粒扩增法扩增WTp53质粒DNA,合成的磁性阳离子高分子脂质体为羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐/胆固醇(OQCMC/Chol)包覆油溶性Fe3O4的载体粒子。在不同的pH值及不同的WTp53质粒DNA和载体粒子质量比的条件下,将WTp53质粒DNA与OQCMC/Chol超微磁性载体粒子进行混合,并分别进行DNA结合实验和沉淀实验。观察电泳结果,并用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。在DNaseⅠ模仿体内酶的环境下,将其加入制备好的超微载体投递系统中,电泳后观察投递系统对DNA的保护作用。应用透析系统模拟体内环境,观察超微投递系统载体与基因分离情况,并利用紫外分光光度计测量超微载体投递系统累积缓释曲线。结果应用透射电镜观察OQCMC/Chol超微磁性载体粒子和WTp53结合后的投递粒子。在pH 7条件下,WTp53质粒DNA和载体粒子质量比为1∶0.6,p53质粒DNA与OQCMC/Chol超微磁性载体粒子经过直接静电作用几乎100%结合,并证实该投递系统对DNA具有较好的保护作用。超微载体投递系统在7～12 h左右有明显的突释波峰,到第54小时以后,超微载体释放浓度变化缓慢,并可持续释放9 d以上。结论成功构建磁性阳离子高分子脂质体结合WTp53投递系统,将为进一步行细胞转染奠定可靠的基础,并为构建血管内靶向定位基因投递新方法和新技术提供可靠理论依据。     

FOLFOX联合靶向药物治疗K-ras野生型晚期大肠癌患者的疗效分析

目的探讨常规化疗药物联合靶向药物对鼠类肉瘤病毒癌基因(K-Ras)野生型晚期大肠癌患者的治疗效果及对患者生存期的影响。方法选取安康市中医医院2016年1月至2017年1月收治的80例K-Ras野生型晚期大肠癌患者,采用随机数字表法将这些患者分为研究组与对照组,每组40例。对照组患者采用常规化疗药物化疗,而研究组患者采用常规化疗药物化疗联合靶向治疗,比较两组患者的肿瘤标志物水平、临床疗效、生存率以及不良反应发生情况。结果治疗后,研究组患者肿瘤标志物水平明显低于对照组患者(P<0.05);研究组患者治疗效果优于对照组患者(P<0.05);研究组患者1、2年生存率分别为75.0%、45.0%,明显优于对照组患者的50.0%和25.0%(P<0.05);治疗后1~5d,两组均有部分患者出现不同程度的发热、恶心呕吐、肝区疼痛等,经对症处理后均在两周内恢复,两组患者的不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论常规化疗药物化疗方案联合靶向治疗对K-Ras野生型晚期大肠癌患者较单纯采用常规化疗药物治疗效果更好,能够有效延长患者生存期,不良反应可耐受,值得临床工作中借鉴应用。     

水疱性口炎病毒对小鼠乳腺癌4T1 细胞荷瘤小鼠抗肿瘤免疫、移植瘤生长与肺转移的影响

目的：探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株（VSV-IN）对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法：VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100 感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR 检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA 的表达。于雌性 BALB/c 小鼠脂肪垫接种1×106个/mL 的4T1 细胞0.1 mL,构建4T1 细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3 ,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇（TAX）（15 mg/kg）、VSV-IN（1×106 pfu/只）,每周1次。给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E 染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T 细胞亚群比例,ELISA 法检测小鼠血清IL-6 及TNF-α水平,利用GEPIA 在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9 与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN 的G 蛋白、M 蛋白与ERK2、E-cadherin 的亲和力。结果：经MOI=10、100的VSV-IN 处理48 h 后,4T1 细胞死亡率显著高于对照组（均P<0.01）;与对照组相比,VSV-IN 组（MOI=10）细胞迁移率明显降低（P<0.01）,MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低（P<0.05）;与对照组小鼠相比,VSV-IN 组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小（P<0.05）,VSV-IN 组小鼠肺转移结节数量显著减少[（12.86±1.86） vs （24±3.67）个,P<0.01],脾内CD4+ T、 CD8+ T 细胞比例显著升高（均 P<0.05）,血清 TNF- α、IL-6含量显著升高（均P<0.01）;GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、 MMP-9表达水平均高于癌旁组织（P<0.05）;VSV-IN 组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组（P<0.05）;VSV-IN 的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为–11.7 kcal/mol、–6.4 kcal/mol。结论：野生型VSV-IN 可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关。     

血浆外泌体淋巴细胞白血病缺失基因1水平对表皮生长因子受体/间变性淋巴瘤激酶野生型进展期非小细胞肺癌患者免疫治疗反应的预测价值

目的 探讨血浆外泌体淋巴细胞白血病缺失基因1(exoDLEU1)在预测表皮生长因子受体（EGFR）/间变性淋巴瘤激酶（ALK）野生型进展期非小细胞肺癌（NSCLC）患者免疫治疗反应中的临床意义。方法 收集2017年6月至2019年2月于浙江省湖州市第一人民医院接受免疫治疗的91例EGFR/ALK野生型进展期NSCLC患者的血液样本,根据免疫治疗后的反应将其分为反应组（53例）和无反应组（38例）。提取两组治疗前血浆外泌体,通过实时荧光定量PCR检测两组exoDLEU1表达,采用logistic回归分析EGFR/ALK野生型进展期NSCLC患者免疫治疗反应情况的影响因素,绘制受试者操作特征（ROC）曲线评估血浆exoDLEU1水平对患者免疫治疗反应情况的预测价值。结果 透射电镜下可见囊泡具有圆形或椭圆形膜,直径为30～150 nm,原始浓度为6.6×1010个粒子/ml,流式细胞仪检测及蛋白质印迹法结果显示,提取物含有外泌体标志物CD63、CD9、CD81、热休克蛋白70。实时荧光定量PCR结果显示,反应组治疗前血浆exoDLEU1水平低于无反应组,差异有统计学意义（P<0.05）...     

阻断NHE1抑制人胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭的研究

目的分析Na⁺/H⁺交换蛋白1（NHE1）抑制剂对癌基因BRAF野生型（BRAF^WT）和激活型BRAF^V600E突变的胶质母细胞瘤（GBM）细胞生长和侵袭能力的影响。 方法NHE1抑制剂Cariporide分别处理U251（BRAF^WT）和AM38（BRAF^V600E）GBM细胞系,乙酰甲酯化的2’,7’-双（2-羧乙基）-5（6）-羧荧光素荧光探针处理细胞并采用紫外分光光度计检测细胞在440 nm与490 nm的荧光强度,计算荧光强度比值以反映NHE1的活性,MTT法检测细胞增殖活性,基质胶-Transwell实验检测细胞侵袭能力。 结果AM38细胞的NHE1活性、增殖和侵袭能力均显著高于U251细胞,差异均有统计学意义（P=0.006、0.010、0.047）;Cariporide处理的U251和AM38细胞的NHE1活性、增殖和侵袭能力均显著低于溶剂二甲基亚砜处理的U251和AM38细胞,差异均有统计学意义（U251：P=0.012、0.023、0.044;AM38：P=0.006、0.001、0.038）。 结论采用Cariporide阻断NHE1活性可有效抑制BRAF^WT和BRAF^V600E突变型GBM细胞的增殖和侵袭。