新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞纯化及培养方法的改进

目的快速纯化大鼠大脑皮质原代星形胶质细胞并进行传代培养。方法取新生2日龄SD大鼠大脑皮层,每2只为一组,将剥除软脑膜的大脑皮层剪碎,添加0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶液500μL,37℃消化15 min,将细胞悬液接种于未用多聚赖氨酸处理过的培养瓶中,37℃、5%CO_2细胞培养箱中孵育15 min后,将细胞以5×10~6个/m L接种于L-多聚赖氨酸包被的T75培养瓶中。待细胞长满瓶底,200 r/min 37℃恒温摇18 h,加入1 m L 0. 25%胰蛋白酶,待大部分细胞悬浮后收集细胞。在倒置相差显微镜下对细胞进行形态学观察,胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色法进行星形胶质细胞纯度鉴定,并以MTS法测定传代后细胞增殖活力。结果星形胶质细胞纯度达到(97. 86±0. 91)%,细胞传代后生长情况及增殖活力良好。结论该方法可以高效获取原代及传代的大鼠大脑皮质星形胶质细胞。     

用于胚胎干细胞分离培养的饲养层的制作

饲养层对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)的培养与建系十分重要。实验选择小鼠原代成纤维细胞(Priimary mouse embmy fibroblasts,PMEF)作为饲养层,这种饲养层能够较好地维持ES细胞未分化状态和二倍体核型。除选用经典的14．5d的孕鼠制做原代成纤维细胞外,我们还选了10d、18d、的孕鼠制成饲养层,通过ES-D3的传代培养结果表明：10-18d的PMEE均可作为饲养层用,10代内的饲养层培养细胞均适宜。     

传代培养角膜细胞的染色体遗传变异率分析

目的 分析传代培养角膜细胞染色体数目的变异率.方法 选择人角膜上皮细胞(HCE)、牛角膜内皮细胞(BCE)和兔角膜上皮细胞(RCE)细胞,采用直接法制备传代细胞染色体标本,常规Giemsa染色,1 000倍光学显微镜下计数分裂相染色体数目,进行核型分析,统计染色体数目变异情况.结果 HCE染色体众数为56 ～ 65,为超二倍体;BCE染色体众数为27 ～ 34,为亚二倍体;RCE染色体众数为74 ～ 88,为超二倍体.与起源细胞相比,以上3种传代细胞染色体数目均发生了改变.结论 该项核型分析为HCE、BCE和RCE 的功能研究提供了重要的参考信息.     

冲击波诱导人骨髓基质细胞成骨分化及机制的研究

目的 观察出生后人骨髓基质细胞(hIMSCs)在体外培养条件下增殖与分化的特点；研究适宜能量冲击波对出生后hMSCs成骨分化的作用及机制。方法 抽取健康自愿者髂骨骨髓，采用密度梯度离心法进行hMSCs体外培养。设冲击波组(SW组)与对照组，应用不同能量级冲击波对SW组原代细胞进行处理，根据细胞活力测定与集落形成数量确定适宜的冲击波能量值。应用适宜的冲击波能量处理hMSCs原代细胞并传代培养，采用倒置显微镜观察、细胞增殖活力测定、ELISA法检测细胞分泌TGF-81、茜素红染色、钙钴法染色、四环素荧光标记、细胞分泌碱性磷酸酶测定和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素mRNA表达等方法，对SW组和对照组的各代细胞形态、增殖与分化及其机制进行探讨。结果冲击波处理体外原代培养hMSCs的适宜能量为10kV(500)。SW组细胞在冲击波处理后早期分泌TGF-B1显著高于对照组(P＜0．001)。SW组与对照组细胞在形态学方面第3代前无明显差别；SW组各代细胞分泌碱性磷酸酶显著高于对照组(P＜0．01)；茜素红染色、钙钴法染色、四环素荧光标记等显示SW组细胞的成骨作用明显优于对照组；SW组细胞经冲击波处理后第10天应用RT-PCR方法可以检测到骨钙素mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．001)。结论 冲击波对体外培养的出生后人骨髓基质细胞具有促进成骨分化的作用，适宜能量为10kv(500)，其机制之一为TGF-B1介导的促hMSCs成骨分化作用。10kV(500)能量级的冲击波对体外培养的hMSCs增殖无影响，大于该能量的冲击波具有抑制细胞增殖的作用。     

人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立人主动脉．性腺-中肾(AGM)区基质细胞系，研究其生长特性及表面标志的表达。【方法】取孕30～35d的人胚胎分离培养AGM区基质细胞，传代培养成系并检测其增殖能力，应用流式细胞术、免疫荧光方法检测其造血相关表面标志和细胞外基质蛋白成分。【结果】人AGM区基质细胞呈成纤维样形态，指数生长期倍增时间约为16h。流式细胞仪检测结果显示CD31、CD34、CD45在人AGM区基质细胞表面为阴性表达，而CD29、CD44、CD105、CD166均为阳性表达。免疫荧光检测结果显示AGM区基质细胞表达细胞外基质蛋白Tenascin、Fibronectin、Laminin及α-SMA。【结论】人AGM区基质细胞系呈现造血组织特异的相关分子表达特征，可以作为研究造血发生机理的模式细胞。     

连续传代人胚骨骼肌成肌细胞生物学特性研究

目的 探讨成肌细胞连续传代能力,选择适宜肌组织工程研究的成肌细胞。方法 常规传代培养人胚骨骼肌细胞,以生长曲线、融合率分别观察细胞增列、分化能力,探讨成纤维细胞沾染对传代细胞的影响。结果 第６代以内细胞成纤维细胞沾染轻,主要表现出成肌细胞的生长特性,增殖较旺盛,分化能力高。第８代￣第１６代细胞成纤维细胞沾染重,表现出成纤维细胞的生长特性,增殖速度明显加快但分化能力低。第２０代细胞退变明显,细胞增殖     

骨髓基质细胞的体外分离与培养及成骨分化的研究近况

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞,其中部分细胞有自我复制、高度增殖和多向分化能力,在特定培养条件下可向骨、软骨、神经胶质细胞、心肌、骨胳肌、脂肪细胞、血管内皮细胞等间叶组织细     

人肾透明细胞腺癌786-O细胞株的传代培养及其生物学特性初探

目的探讨人肾透明细胞腺癌786-O细胞株体外培养的生长特性,为进一步的实验研究积累经验。方法将786-O细胞株于体外培养,进行传代、冻存、复苏和细胞计数等操作,并绘制细胞生长曲线。结果786-O细胞株在体外被成功培养,生长较快,每3天传代1次。细胞生长曲线呈S形,分为潜伏期、对数生长期和停滞期,细胞倍增时间大约36 h。结论786-O细胞株能在体外稳定地传代培养。     

胰岛素生长因子在组织工程领域应用的研究进展

组织工程学是应用细胞生物学和工程学的原理,研究开发修复、改善损伤组织结构和功能的一门科学。其研究需具备以下条件：①合适的细胞支架;②足够数量且功能正常的种子细胞;③调节该细胞增殖、保持表型等特征的细胞因子。但由于种子细胞在体外传代培养后极易衰老,且在体外培养的种子细胞增殖能力低下,从而限制了各种组织工程化器官的研究应用。因此,细胞因子在组织工程领域的地位就显得十分重要。     

体外传代培养对人视网膜色素上皮细胞免疫调控能力的影响

目的 研究体外传代培养对人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelialium,HRPE)细胞免疫调控能力的影响.方法 建立HRPE细胞与异体淋巴细胞共培养系统,采用流式细胞术检测原代及传代HRPE细胞(第1、2、3、4、5、6代)Fas表达以及诱导异体淋巴细胞凋亡能力的差异.结果 HRPE与淋巴细胞体外共培养时,HRPE细胞Fas表达随着传代逐渐减弱,Fas表达与传代代数呈负相关(阳性细胞率r=-0.859,P＜0.001;平均荧光强度r=-0.880,P＜0.001),HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡随着传代逐渐减弱,淋巴细胞凋亡率与传代代数呈负相关(r=-0.838,P＜0.001),共培养时传代HRPE细胞Fas表达迅速下降,至第3代与第4代间Fas表达差异无统计学意义(P＞0.05),共培养时传代HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡率迅速下降,至第3代与第4代问淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外传代培养的HRPE细胞,传代数越大细胞变异越大,第3代后细胞的免疫调控能力明显下降.