转人GM—CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及体外生物学特性

经逆转录病毒载体将人GM-CSF基因导入人膀胱癌细胞株BIU-87细胞中,建立了转基因细胞株BIU/GM。经流式细胞仪行细胞DNA周期分析表明GM-CSF基因的导人及表达对BIU-87细胞的增长无影响。免疫荧光测定发现转GM-CSF基因及表达不能促进BIU-87细胞表面HLA-ABC、DR、DQ抗原的表达。转基因瘤细胞株经6000rad X射线照射灭活后,丧失增殖能力,逐步死亡,但能维持一定水平的GM-CSF分泌活性达两周以上。从而为制备灭活的转基因瘤苗提供了初步经验。     

人肝癌特异性EB病毒载体—p^EBAF介导hGM—CSF基因的转移及表达

目的：探索人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法：构建p^EBAF/hGM-CSF基因克隆,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白（AFP）的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两围基因的细胞克隆HepG2/hGM-CSF,SMMC7721/hGM-CSF,用MTT比色法测定细胞上清中hGM-CSF活性。结果：HepG2/hGM-CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46．5ng/ml/10^6/24h,SMMC7721细胞上清中无明显hGM-CSF活性。结：载体p^EBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。     

乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建

目的 体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—macrophage colony stimulatingfactor，hGM—CSF），并构建载体pNCSF。方法 根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子，将hGM—CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段，并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点，将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应，完成hGM-CSF基因拼接，得到目的基因片段，对寡核苷酸片段进行拼装和扩增．产物稀释后进一步纯化扩增，在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T，然后TA克隆于pGEM T easy载体中，经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段，获得了hGM—CSF和pNCSF阳性克隆。其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论 运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM—CSF基因及构建了载体pNCSF，为乳酸链球菌表达重组hGM—CSF奠定了基础。     

Construction of eukaryotic expression vector with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene

Recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(rhGM-CSF)hasbeenwidelyusedinclinicsinceitwasclonedin1985.11]Itisnotonlyaneffectivehematopoiesisgrowthfactor,butalsoacytokinesthatcanstimulatethepowerfullyefficientandpersistentantitumoractivityinallbody.[']Inthisstudy,thehumanGM~CSFgenewasamplifiedbyRT-PCR,andthenreconstructedintoeukaryoticexpressionplasmidtomakeitefficientlyandpersistentlyexpressinmammaliancells.TheseresultsprovidedabasisforstudyofGM-CSFincancergenetherapy…     

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。     

用夹心酶联免疫法研究hGM－CSF在大鼠体内的药物代谢动力学

用灵敏的夹心酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）建立了检测重组人ｈＧＭ－ＣＳＦ药代动力学的方法。此方法ｈＧＭ～ＣＳＦ在１２．５～０．３９ｎｇ·ｍｌ￣（－１）范围内，检测呈线性相关。最低检测灵敏度为０．４ｎｇ·ｍｌ￣（－１）。本方法不受血清中潜在干扰因素的影响，检测具高度特异性。大鼠ｓｃｈＧＭ－ＣＳＦ５０，１００，２００μｇ·ｋｇ￣（－１）后１５ｍｉｎ，血中即有较高浓度的ｈＧＭ－ＣＳＦ，１ｈ左右达峰浓度，以后快速下降。皮下给药，尿中可检测到原型ｈＧＭ－ＣＳＦ，但累积排泄率较低。本研究为临床合理用药提供依据。     

用夹心酶联免疫法研究hGM-CSF在大鼠体内的药物代谢动力学

用灵敏的夹心酶联免疫法(ELISA)建立了检测重组人hGM-CSF药代动力学的方法。此方法hGM-CSF在12.5～0.39ngml^-1范围内,检测呈线性相关。最低检测灵敏度为0.4ngml^-1。本方法不受血清中潜在干扰因素的影响,检测具高度特异性。大鼠schGM-CSF50,100,200μgkg^-1后15min,血中即有较高浓度的hGM-CSF,1h左右达峰浓度,以后快速下降。皮下给药,尿中可检测到原型hGM-CSF,但累积排泄率较低。本研究为临床合理用药提供依据。     

Recombinant hybrid protein, Shiga toxin and granulocyte macrophage colony stimulating factor effectively induce apoptosis of colon cancer cells

AIM: To investigate the selective cytotoxic effect of constructed hybrid protein on cells expressing granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor. METHODS: HepG2 (human hepatoma) and LS174T (colon carcinoma) were used in this study. The fused gene was induced with 0.02% of arabinose for 4 h and the expressed protein was detected by Western blotting. The chimeric protein expressed in E.coli was checked for its cytotoxic activity on these cells and apoptosis was measured by comet assay and nuclear staining. RESULTS: The chimeric protein was found to be cytotoxic to the colon cancer cell line expressing GM-CSFRs, but not to HepG2 lacking these receptors. Maximum activity was observed at the concentration of 40 ng/mL after 24 h incubation. The IC50 was 20±3.5 ng/mL. CONCLUSION: Selective cytotoxic effect of the hybrid protein on the colon cancer cell line expressing GM-CSF receptors (GM-CSFRs) receptor and apoptosis can be observed in this cell line. The hybrid protein can be considered as a therapeutic agent.     

毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析

为了探索利用毕赤氏酵母系统表达和生产人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,hGM-CSF)的可行性,使用经改造的hGM-CSF基因构建pGAPZα-A/hGM-CSF分泌型表达载体,转入毕赤氏酵母SMD1168(his 4,pep 4)菌株和GS115(his 4)菌株,利用斑点杂交技术筛选hGM-CSF基因阳性菌株,利用SDS-PAGE和TF-1依赖细胞株/MTT比色法对工程菌株的分泌产物进行表达和生物活性分析,最后筛选得到7个hGM-CSF基因阳性菌株,其中有3个工程菌株的杂蛋白较少且主带蛋白质相对分子质量与经改造的hGM-CSF基因相对分子质量保持一致,这3个工程菌株的分泌蛋白质样品都具有天然hGM-CSF的生物活性,经初步提取,活性单位分别为2.28×105U/ml、2.22×105U/ml和2.46×105U/ml.从而证明利用毕赤氏酵母系统表达hGM-CSF是可行的,为hGM-CSF的生产和临床应用打下了基础.     

转hGM—CSF基因肿瘤细胞疫苗抗肿瘤作用的实验研究

利用逆转录病毒中介基因转移体系将ｈＧＭ—ＣＳＦ基因导入大鼠Ｗａｌｋｅｒ瘤细胞ＷＴ２５６中，经ＰＣＲ和ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测证实，ｈＧＭ—ＣＳＦ基因已成功导入ＷＴ２５６细胞，生物学活性检测表明，转基因瘤细胞分泌一定水平ｈＧＭ—ＣＳＦ。转基因细胞经Ｘ线灭活，接种荷瘤的Ｗａｌｋｅｒ瘤模型，诱导了有效的抗肿瘤免疫反应