IV型胶原片段阻滞原的基因克隆及原核表达研究

目的 克隆中国人阻滞原基因并高效表达。方法 利用高保真聚合酶链反应（HF-PCR）从胎肝细胞QSD胞克隆Ⅳ型胶原α1链NC1结构域编码序列，即阻滞原基因。并进行序列分析。将阻滞原基因克隆入表达载体pQE-31，转化大肠杆菌M15[pREP4]并用IPTG诱导蛋白表达，蛋白电泳鉴定重组阻滞原蛋白。结果 从胎肝细胞克隆的人阻滞原基因长687bp，编码229个氨基酸。大肠杆菌表达的重组阻滞原N-末端与载体编码的组氨酸标签形成融合蛋白；SDS-PAGE分析显示，经IPTG诱导后可出现28kd的目的蛋白条带。最高可占总菌体蛋白的32%，结论 该法可成功克隆阻滞原基因。将有助于肿瘤血管抑制疗法的深入研究。     

Eukaryotic Expression of Human Arresten Gene and Its Effect on the Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells

Arresten,human noncollagenous domain 1 oftheα1 chain of type Ⅳcollagen,is derived fromthe carboxy terminal of type Ⅳcollagen[1].It wasidentified as a powerful inhibitor of angiogenesisrecently .In earlier studies , human arresten wassuccessfully amplified from placenta tissue , andmolecular cloning and DNA sequencing verifiedthat the coding sequence obtained was correct[2].Prokaryotic expression vector of arresten gene hasbeen constructed[3]. Excessive proliferation andmigration to endome…     

Arresten对血管平滑肌细胞作用和机制的研究

目的探讨arresten蛋白对人血管平滑肌细胞的作用以及可能的相关调控机制。方法采用实时活细胞动态成像实验检测不同浓度arresten对血管平滑肌细胞增殖能力的影响;采用蛋白芯片检测在arresten作用下血管平滑肌细胞内差异性表达的相关细胞因子;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关细胞因子的差异性表达。结果实时活细胞动态成像显示arresten能够抑制血管平滑肌细胞增殖水平;蛋白芯片实验显示arresten作用下血管平滑肌细胞内Angiogenin、Endoglin及TIMP-1具有差异性表达;RT-PCR结果验证了在arresten作用下血管平滑肌细胞内Angiogenin的差异性表达,Endoglin和TIMP-1表达差异不明显。结论arresten对血管平滑肌细胞增殖有抑制作用,其机制可能通过Angiogenin参与信号通路的调节来发挥作用。     

The inhibitory effects of arresten protein on tumor formation

To examine the inhibitory effects of recombinant purified arresten on tumor formation.Methods Purified arresten protein was incubated with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and HeLa cell...     

Construction of eukaryotic expression vector of human arresten gene and its secreted expression in HEK 293 cells

The eukaryotic expression vector of human arresten gene was constructed and its secretive expression human embryonic kidney (HEK 293) cells was detected. Human arresten gene was amplified from recombinant plasmid pGEM-Arr by polymerase chain reaction (PCR), and then digested with restriction endonucleases BamH I and EcoR I. The target fragment was inserted into the BamH I and EcoR I restriction sites of eukaryotic expression vector pSecTag2 to construct pST-AT. Restriction analysis and DNA sequencing indicated that the arresten gene was successfully inserted into pSecTag2. The recombinant plasmid was subsequently transfected into HEK 293 cells with LipofectAMINETM2000 Reagent, and the expression of the target gene was detected. RT-PCR revealed that the mRNA of the target gene was transcribed in the transfected HEK 293 cells. Western Blot analysis verified that the recombinant protein in supernatants was correct. The supernatants of transfected cells were prepared, and 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) assay was carried out to assess their effect on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells, which showed that the recombinant protein could significantly suppress the proliferation of human umbilical vein endothelial cells in vitro. These results provided a solid foundation to explore the usage of arresten in tumor anti-angiogenic gene therapy.     

arresten基因转染对裸鼠实验性结肠癌肝转移的抑制作用

背景与目的:肝转移是晚期结肠癌患者最常见的致死原因,也是最常见的内脏转移,高达50%以上的结肠癌患者都会出现肝转移.本研究探讨arresten基因转染对人结肠癌LoVo细胞形成的裸鼠实验性结肠癌肝转移的影响.方法:通过脂质体转染法将arresten基因导入LoVo细胞,RT-PCR、Western blot分别检测arresten在mRNA、蛋白水平的表达,四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测arresten对LoVo细胞增殖的影响;通过建立裸鼠实验性结肠癌肝转移模型了解arresten对肿瘤转移的抑制作用;FⅧRag多克隆抗体染色的免疫组化方法检测肿瘤组织的微血管密度(microvessel density,MVD).结果:RT-PCR、Western blot结果显示arresten基因成功导入LoVo细胞并有arresten蛋白的表达.MTT比色法显示不同浓度的arresten对LoVo细胞增殖的影响差异无统计学意义(P＞0.05).导入arresten基因的LoVo细胞转移率为(25.1±2.1)%,低于未导入arresten基因的LoVo细胞的(87.1±1.2)%和对照组的(87.1±1.5)%,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSecTag2-arresten组裸鼠形成的肿瘤结节数为4.5 0.5,低于另外两组的19.6±2.5和20.4±2.5,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSeeTag2-arresten组形成的肿瘤MVD为15.3±3.5,低于另外两组(分别为42.2±2.6、45.6 5.1),其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论:arresten能抑制结肠癌肝转移,其作用机制可能与arresten抑制肿瘤血管生成有关.     

arresten cDNA在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及活性鉴定

目的：构建arresten cDNA的分泌型真核表达载体，将其转染人胃癌SGC-7901细胞，探讨arresten体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR法将小鼠Igκ链信号序列的60个碱基拼接至arresten cDNA的氨基端，并克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )，然后以脂质体法将重组pcDNA3．1( )-arresten转染SGC-7901细胞，Western印迹检测arresten的分泌表达，最后，提取SGC-7901细胞培养上清，采用内皮细胞增殖抑制试验鉴定上清中arresten活性。结果：成功构建了arresten cDNA的分泌型真核表达载体，获得可表达arresten的SGC-7901细胞系，真核表达的arresten具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。结论：arresten是一种有效的血管生成抑制剂，其cDNA的真核表达载体的成功构建为针对人类胃癌的arresten抗血管基因治疗研究奠定基础。     

Arresten对人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其作用机制

背景与目的：Arresten是近年发现的血管生成抑制因子，它能抑制裸鼠移植瘤的生长和转移。本文探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖的影响及其相关机制。方法：应用MTT法测试细胞的生长曲线，检测不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响，流式细胞仪检测arresten对huvec细胞凋亡的影响，半定量RT—PCR及Western—blot分别检测人脐静脉内皮细胞的VEGF在mRNA水平及蛋白水平的表达。结果：Mr丌比色法显示，arresten对huvec细胞增殖具有抑制作用并呈浓度依赖性，但当其浓度增加到800ng／L后其增殖抑制率不再提高，而此浓度时huvec细胞的凋亡率达到峰值的59％；经过arresten处理，huvec细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平的表达量均显著下降。结论：arresten通过降低huvec细胞的VEGF表达抑制huvec细胞增殖并促进huvec细胞凋亡。     

Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制

目的　探讨Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制。方法　选取48只出生后7 d健康清洁级C57BL/6J幼鼠,随机分为氧诱导视网膜病变（oxygen induced retinopathy,OIR）组、OIR+ Arresten组和常氧组,每组16只。OIR+Arresten组及OIR组幼鼠在体积分数为（75±2）％的高氧环境下饲养5 d,然后转移至正常氧气环境中饲养5 d,其中OIR+Arresten组幼鼠于高氧饲养刚结束时,给予双眼玻璃体内注射Arresten蛋白。常氧组幼鼠则在常规氧气环境中连续饲养10 d。在鼠龄17 d时,各组取6只幼鼠经股静脉注射异硫氰酸葡聚糖溶液处死并摘出眼球,视网膜铺片后观察视网膜的血管形态、计算无灌注区面积。同时对小鼠眼球视网膜行石蜡切片和HE染色,计算侵入玻璃体内血管内皮细胞核的数量。同时,通过细胞培养实验,利用MTT法检测Arresten蛋白对人血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果　视网膜铺片结果显示,常氧组、OIR组、OIR+Arresten组视网膜无灌注区相对面积分别为（2.35±1.62）％、（57.28±9.36）％和（20.38±8.69）％,三组间总体比较,差异有统计学意义（F=18.732,P<0.05）,且OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+Arresten组,差异有统计学意义（P<0.05）。常氧组小鼠视网膜的内界膜结构仍保持平滑完整,未发现有新生血管侵入玻璃体内。OIR组和OIR+Arresten组每张切片上血管内皮细胞核的数量分别为 （15.18±4.83）个、（7.33±3.88）个,其中OIR+Arresten组侵入玻璃体内新生血管内皮细胞核的数量显著低于OIR组,差异有统计学意义（P<0.05）。Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制率随着其浓度的升高而增加,但当Arresten蛋白浓度达到1000 μg·L^-1时,人脐静脉内皮细胞的增殖抑制率达到顶峰,为（58.00±0.65）％。结论　Arresten蛋白能够抑制氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成,通过抑制血管内皮细胞增殖来抑制新生血管形成。