骨髓源间充质干细胞在异基因小鼠免疫器官内的分布及其免疫功能调节作用

目的：探讨骨髓源间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)在异基因小鼠免疫器官内的分布及其免疫调节作用。方法：以CM-Dil荧光染料示踪BMSC的体内分布情况，并辅以PCR检测Y染色体的方法进一步鉴定；体外实验采用MTT法、ELISA和FACS等方法检测BMSC的免疫调节作用。结果：BMSC可进入并较长期(30天)存在于异基因小鼠免疫器官内；在体外，BALB／C小鼠的BMSC对由ConA诱导的BALB／C和C57BL／6(B6)和BXSB小鼠的T细胞增殖均有抑制作用；而对前两种小鼠由12S诱导的B细胞增殖和分泌k方面表现为促进作用，对BXSB小鼠由IPS诱导的B细胞增殖和k分泌有抑制作用。BALB／C小鼠的BMSC对BALB／C和B6小鼠由ConA诱导的IL-4生成细胞的数量无明显影响，却可降低由ConA诱导的两种品系小鼠的IFN-γ生成细胞的数量；但对于BXSB小鼠却不同，BALB／C的BMSC可降低由ConA诱导的BXSB小鼠的IL-4生成细胞的数量，而提高由ConA诱导的IFN-γ生成细胞的数量。结论：异基因BMSC不但可进入受体的免疫器官，且可较长期(30天)存在；另外，BMSC对同基因正常、异基因正常和异基因自身免疫病的个体均有一定程度的免疫调节作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对非贴壁骨髓基质前体细胞增殖及分化作用的研究

目的　探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对非贴壁骨髓前体细胞的增殖及分化作用。方法　分离骨髓前体细胞体外培养 ,用碱性磷酸酶化学染色及图像分析仪测定细胞克隆数 ;采用免疫组化 (ABC法 )检测PCNA、Ⅰ型胶原、钙及骨钙素。研究bFGF对非贴壁前体细胞的促增殖及分化作用。结果　骨髓细胞中许多基质前体细胞以非贴壁前体细胞 (NASP)形式存在 ,bFGF不仅能促进其增殖 ,而且能诱导其向成骨细胞分化。结论　bFGF主要作用于非贴壁生长的基质前体细胞 :能增加骨细胞的数量 ,促进骨样组织形成 ,为临床用bFGF治疗骨折、骨不连提供理论依据。     

不同引经药对股骨头坏死模型兔骨髓干细胞归巢的影响

目的:观察比较活骨Ⅱ方配伍不同引经药对液氮冷冻性股骨头坏死(ONFH)兔股骨头内骨髓干细胞归巢的影响,探讨其防治ONFH的作用机制。方法:84只兔经液氮冷冻法建立股骨头坏死模型后,随机分为模型、活骨Ⅱ方及活骨Ⅱ方分别加牛膝、细辛、独活和桔梗(简称活骨、牛膝、细辛、独活和桔梗)等6组,另14只设为假手术组。在造模同时所有动物均皮下注射rhG-CSF(30μg.kg-1.d-1,连续7 d),并分别灌胃生理盐水和相应中药。于注射rhG-CSF前后分别进行外周血WBC计数。分别于给药2周和4周后,股骨头经HE染色观察组织病理学改变,血管墨汁灌注观察血管形态,免疫组织化学法检测BrdU及SDF-1的表达。结果:与假手术组相比,模型组股骨头空骨陷窝率明显升高,血管面积和SDF-1蛋白表达水平显著降低;与模型组相比,活骨Ⅱ方组股骨头空骨陷窝率降低,血管面积增大、BrdU阳性细胞数和SDF-1表达升高;与活骨Ⅱ方组比较,牛膝组给药4周时股骨头内空骨陷窝率降低、血管面积增大,2周时SDF-1表达增高;桔梗组股骨头内空骨陷窝率有增高趋势,4周时BrdU阳性细胞数明显减少;细辛和独活组无明显变化。结论:活骨Ⅱ方能通过促进动员起来的骨髓干细胞定向归巢从而防治股骨头坏死;引经药牛膝可进一步提高活骨Ⅱ方的上述作用。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-4对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和神经分化的影响

目的探究胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)对骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖和神经分化的影响。方法通过全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,免疫荧光检测IGFBP4在P1、P4、P6、P8和P10 BMSCs的表达。取第4代BMSC细胞,分为单纯培养基组和添加IGFBP4组,用CCK8试剂盒检测单纯培养基组和添加IGFBP 4组吸光度值A450 nm。再将BMSC细胞分为3组:neurocult组、EGF+b FGF组、EGF+b FGF+IGFBP4组,每组连续测定7 d,每天6个平行孔,诱导培养基Neuro Cult培养再分别添加EGF+b FGF和EGF+b FGF+IGFBP4,诱导其向神经祖细胞分化,免疫荧光染色检测Nestin和Sox-2表达,并观察神经球数量和细胞增殖活性。结果成功获得原代大鼠BMSCs,可见CD105、CD44和CD90表达,IGFBP4的表达随培养代数而增加,外源IGFBP4能明显抑制BMSCs的增殖(P0.05)。经诱导BMSCs形成的神经球样结构表达Nestin和Sox-2,细胞增殖活性升高(P0.05)。结论 IGFBP4能抑制BMSCs的增殖,促进其向神经祖细胞分化。     

新型骨组织工程β-TCP／CPPF／PLLA支架复合BMSCs修复节段性骨缺损的影像学研究

目的：将自体骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）接种到β-TCP／CPPF／PLLA支架上,进行体外复合培养,构建组织工程人工骨,植入兔桡骨大段骨缺损模型中,评估BMSCs／β-TCP／CPPF／PLLA复合体促进成骨的作用。方法：用新西兰大白兔40只,随机分为BMSCs／β-TCP／CPPF,PLL复合物组（A组）、β-TCP／CPPF／PLLA支架组（B组）、空白对照组（C组）共三组,建立兔桡骨双侧大段骨缺损模型,相应植入自体细胞材料复合物和单纯支架材料,空白对照组不作任何处理。术后4、8、12、16周处死动物,摄X线片观察骨缺损修复情况。结果：X线检查结果：A组术后2周可见缺损处有散在的、少量的模糊状骨痂生成,术后4周可见明显的骨生成影像,成云雾状,均匀分布在骨缺损区,术后8周整个缺损区均可见到骨痂生成,成骨现象较4周更加明显,部分髓腔已通,术后12～16周,缺损区已完全为新生的骨组织充填,骨髓腔已完全再通,修复区比正常的桡骨较细。B组、C组术后2～16周,虽有不同程度的成骨现象,但没有完全修复骨缺损区,B组较C组修复明显。X线评分结果：A组在各时期均明显高于B组,差异具有显著性（P〈0．01）。结论：自体BMSCs与β-TCP／CPPF／PLLA复合物移植能修复大节段的骨干缺损。     

H2O2预处理对骨髓间质干细胞凋亡适应性保护作用的研究

 【目的】 探讨低浓度H2O2预处理对高浓度H2O2引起骨髓间质干细胞凋亡的影响.【方法】 大鼠骨髓间质干细胞(BMSC)经体外培养扩增、纯化、鉴定.BMSC分别被暴露于0,50,100,200,300,400,500 μmol/L H2O2,流式细胞仪(FCM)检测不同浓度H2O2处理对BMSC细胞凋亡的影响.然后分别用20 μmol/L ,50 μmol/L,100 μmol/L H2O2预处理24 h,用FCM和Hoechst33324染色观察低浓度H2O2预处理对高浓度H2O2引起骨髓间质干细胞凋亡的影响, RT-PCR检测不同浓度H2O2预处理组BMSC Caspase-3和Bcl-2基因的表达.【结果】 BMSC经体外培养扩增、流式细胞仪鉴定,符合其表面标志,FCM检测凋亡显示:H2O2呈浓度依赖性诱导BMSC凋亡,且50 μmol/L H2O2预处理可降低500 μmol/L H2O2诱导的BMSC凋亡率;Hoechst33324染色结果显示:对照组BMSC染色质分布均匀,为弥散均匀的低强度荧光;500 μmol/L H2O2组BMSC胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光;50 μmol/L H2O2预处理组所致的凋亡细胞数明显少于500 μmol/L H2O2处理组所引起的细胞凋亡数,100 μmol/L H2O2预处理组所致的凋亡细胞数与500 μmol/L H2O2处理组比较无明显差异、RT-PCR结果显示50 μmol/L H2O2预处理组与单独使用500 μmol/L H2O2处理组比较,其BMSC的Bcl-2表达增加和Caspase-3基因表达降低(P < 0.05),100 μmol/L H2O2预处理组与单独使用500 μmol/L H2O2处理组比较,其BMSC的Bcl-2、Caspase-3表达无明显差异(P > 0.05)。 【结论】 低浓度H2O2预处理对BMSC凋亡具有适应性保护作用,其机制可能与H2O2预处理使BMSC Bcl-2基因表达增加和Caspase-3基因表达降低有关。     

超声波促骨髓间充质干细胞心肌内归巢的实验研究

目的探讨超声微泡造影剂介导对猪骨髓干细胞（BMSC）心肌内移植归巢的影响。方法选取8只2月龄中国家猪随机分为对照组（A组，4只）和实验组（B组，4只）。分别抽取骨髓，体外分离、纯化，培养BMSC，超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO）标记；介入法建立急性心肌梗死模型。B组超声微泡作用下移植Busc（1MHz，2W／cm^2，90s辐射）；A组不采用超声微泡干预BMSC移植过程。两组动物于术后24h活体行磁共振检查，对比BMSC移植，随后处死动物，取心肌梗死区、梗死周边区、正常区做病理切片，行HE染色及普鲁士蓝染色，心肌消化后涂片普鲁士蓝染色后计数BMSC。结果①SPIO成功标记干细胞，因此，活体行磁共振示踪BMSC成为可能。②磁共振：A组及B组在心肌梗死区和梗死周边区均见SHO标记的BMSC形成的低密度区，低信号区B组较A组多。③普鲁士蓝染色：两组心肌消化涂片染色，BMSC在B组较A组有明显地增加（P〈O．05）。结论超声联合微泡剂介导的猪自体BMSC心肌内移植有所增强，该方法为提高干细胞移植归巢效率提供一种新的思路。     

异基因人骨髓间充质干细胞与外周血单个核细胞体外共培养的相互影响

目的：探讨异基因骨髓间充质干细胞（BMSC）与外周血单个核细胞（PBMC）在体外共培养的相互影响。方法将异基因成人来源的BMSC与PBMC在体外分别按1：10混合共培养,采用氚胸腺嘧啶核甙掺入方法检测PHA刺激PBMC增殖的活性,采用ELISA方法检测培养液中分泌的IL-6、IL-8和PGE2水平。结果 BMSC与PBMC共培养组的PBMC增殖率明显减少（P〈0.01）,抑制率均超过50%。加入PBMC共培养后,BMSC分泌IL-6、IL-8和PGE2显著增加（P〈0.01）。结论 BMSC可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖,PBMC可以促进BMSC分泌免疫活性因子,BMSC可能具有双向的免疫调控作用。