通用引物PCR-SSCP技术分析16Sr RNA基因特征快速鉴定细菌

目的探讨通用引物聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术在细菌检测中的应用.方法选取9种常见的细菌,采用通用引物对细菌的16SrRNA基因进行PCR扩增,产物进行单链构象多态性分析,并以标准菌株为对照.结果一对引物扩增产物SSCP图谱各细菌之间难以区别;两对引物扩增产物SSCP图谱条带数目、相对迁移率及条带之间的间距存在明显,可相互区别;3种细菌的标准菌株和临床菌株的SSCP图谱完全一致.结论采用针对16SrRNA的通用引物PCR-SSCP技术以标准菌株为对照可方便快捷地检测细菌.     

常见食源性感染致病菌属、种用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术鉴定探讨

[目的]探讨运用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性分析(IZCR-RFLP)和聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性。[方法]选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因，通过设计合适的通用引物进行PCR扩增，并对13属食源性感染常见致病菌和5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCF，分析。[结果]运用通用引物可以扩增出13属食源性感染常见致病菌的23S rDNA基因Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明，不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱，利于进行细菌属的鉴定。不同种属食源性感染常见致病菌SSCF，图谱变异性更大，不利于进行种属间鉴别。对5种不同血清型大肠杆菌的23S rDNA基因扩增产物的RFLP和SSCP分析表明，不同血清型大肠杆菌表现出相似的RFLP图谱，SSCP图谱的变异性较大，这有利于进行血清型间鉴别甚至株间的鉴别。[结论]PCR-RFLP和PCR-SSCP具有应用于食源性感染常见致病菌种、属鉴别诊断的潜力。     

胆碱酯酶重活化剂PAM类构型、构象问题

本文参考X-衍射数据,采用MNDO程序计算了不同构型、构象PAM类的生成热,结合核磁共振数据讨论了PAM类构象等问题.结果表明,PAM类在水溶液中:顺式体肟基可以自由旋转,任何一种构象都可能成为药效构象;反式体肟基本不可能存在稳定的平面构象,其药效构象只能是优势构象.用MNDO程序中反应途径的计算法,还计算了顺、反式肟基构型相互转变的势垒,为探讨PAM类重活化机理提供了一定的参考.     

药物-受体作用的相互适应关系

药物-受体相互作用是复杂的,药物和酶的作用也与之类似,任何结构参量与活性之间的线性关系仅仅存在于一定范围之内,每个结构因素的某些微小变化都可能引起药理性质的明显改变。讨论药物构效关系及进行新药物设计时,应该多考虑药物分子的整体统一性,不必过分强调单因素的完美线性关系。提出并讨论了药物-受体之间存在相互适应原理,其中包括:空间效应与几何互补关系、构象调节与构象改变最小原理、范德华力、油水分配系数与生物活性之间的曲线关系、药物-受体分子轨道作用的适宜量值等。     

结核分支杆菌链霉素耐药的快速检测

【目的】探讨用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)方法快速诊断结核分支杆菌链霉素 (Sm)耐药的临床意义。【方法】用PCR SSCP技术检测了 30株Sm敏感的结核分支杆菌临床分离株 ,30株Sm耐药的临床分离株 ,以结核分支杆菌H37RV标准株作对照。先用PCR方法扩增rpsL基因 ,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变。【结果】所有临床分离株均观察到rpsL基因PCR扩增产物。 30株Sm敏感的临床分离株与H37RV标准株呈现一样SSCP泳动条带 ,30株Sm耐药株中 19株有rpsL基因泳动异常 ,提示约有 6 3 %Sm耐药菌株有rpsL基因突变。【结论】本研究提示用SSCP方法容易鉴定出rpsL基因的点突变 ,PCR SSCP技术可作为快速鉴定结核分支杆菌Sm敏感性的有用工具 ,对结核分支杆菌Sm耐药的快速诊断有较大价值。     

钙池操纵的Ca2+通道的激活机制研究进展

钙池操纵的Ca~(2 )通道(store-operated Ca~(2 ) channels,SOC)是非兴奋细胞Ca~(2 )内流的主要通道之一,参与多种病理和生理过程,在钙信号通路的研究中,SOC的激活机制一直是人们关注的焦点之一,迄今为止,钙内流因子模型(Ca~(2 ) innux factor model,CIF model)和构象耦联模型fconformational coupling model)受到广泛关注.部分学者已经从很多不同类型的细胞中提取出CIF,并证实钙非依赖性的磷脂酶A_2(Ca~(2 )-independent phospholipase A_2,iPLA_2)作为CIF的底物,在某些类型细胞的SOC激活过程中发挥重要作用,并进一步提出了ER- CIF-iPLA_2-CaM-LysoPLs-SOC通路模型.瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道蛋白与1.4,5-磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5 trisphosphate receptor,IP_3R)的结构连接作为构象耦联模型的基础已被广泛证实,随着对IP_3R,Ryanodine受体、肌动蛋白等在钙信号通路中所发挥作用的深入研究,构象耦联模型将得到不断补充和完善.SOC激活机制的破解,将对进一步完善非兴奋细胞的钙通道特性及其调节机制理论带来重大突破.     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

毛细管电泳技术快速检测p53基因点突变

目的：探讨利用毛细管电泳技术快速检测p53基因点突变的临床应用价值。方法：采用毛细管电泳作SSCP分析，检测20例结肠癌肿瘤标本p53基因第7外显子PCR扩增产物，并与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果进行比较，最后用DNA序列测定判断其准确性。结果：20例结肠癌标本中，毛细管电泳技术检测出5例标本(Ca4，Ca6，Ca7，Ca8，Ca14)有突变，而凝胶电泳结合银染技术仅检出4例标本(Ca4，Ca6，Ca7，Cal4)有突变，测序证实经毛细管电泳所检出的5例标本均存在点突变。结论：对于PCR产物的单链构象多态性分析，毛细管电泳技术是一种更加快速、简便、敏感的方法，可应用于临床筛查基因点突变。     

Ro抗原的提取及Ro构象对其抗原反应性的影响

本文报道了了一种从人脾组织提取高活性Ｒｏ自身抗原的快速简易方法，并进一步证明Ｒｏ构象对其抗原反应性影响极大。     

MUS81基因在喉癌中的突变和表达

目的 探讨MUS81基因突变和表达与喉癌发生发展的相关性.方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术结合DNA测序检测分析了42例喉癌患者MUS81基因第9、10外显子的突变;应用半定量逆转录-PCR和Western印迹方法分析MUS81基因在喉癌组织中的表达情况.结果 42例喉癌、癌旁组织标本中,癌旁正常组织均无突变,喉癌组织标本中19例发生突变,占45.2%(19/42),11例喉癌组织第9外显子发现有突变,占26.2%(11/42),8 例喉癌组织第10外显子有突变,占19%(8/42),分析表明具有统计学意义(P<0.01).逆转录-PCR结果表明,42例喉癌中有17例MUS81基因mRNA低表达,占40.48%(17/42).Western印迹方法分析结果表明,42例喉癌中有17例MUS81蛋白质低表达,占40.48%(17/42),经统计学分析肿瘤组与对照组差异有统计学意义(P<0.01).分析表明MUS81基因突变与mRNA和蛋白质低表达有显著相关性(P<0.01).统计结果显示喉癌MUS81基因突变与TNM分期、年龄和淋巴结转移无相关性(P>0.05).MUS81基因低表达与TNM分期、年龄和淋巴结转移无相关性(P>0.05).结论 发现MUS81基因在喉癌组织中有突变发生及表达异常,提示MU81基因突变和表达异常可能是喉癌发生及发展的重要因素之一.