An Evolutionarily Conserved Region in the Second lntron of the Human Nestin Gene Directs Gene Exmession to CNS Progenitor Cells and to Early Neural Ciest Cells

Central nervous system (CNS) progenitor cells transiently proliferate in the embryonic neural tube and give rise to neurons and glial cells. A characteristic feature of the CNS progenitor cells is expression of the intermediate filament nestin and it was previously shown that the rat nestin second intron functions as an enhancer, directing gene expression to CNS progenitor cells. In this report we characterize the nestin enhancer in further detail. Cloning and sequence analysis of the rat and human nestin second introns revealed local domains of high sequence similarity in the 3' portion of the introns. Transgenic mice were generated with the most conserved 714 bp in the 3' portion of the intron, or with the complete, 1852 bp, human second intron, coupled to the reporter gene lacZ. The two constructs gave a very similar nestin-like expression pattern, indicating that the important control elements reside in the 714 bp element. Expression was observed starting in embryonic day (E)7.5 neural plate, and at E10.5 CNS progenitor cells throughout the neural tube expressed lacZ. At E12.5, lacZ expression was more restricted and confined to proliferating regions in the neural tube. An interesting difference, compared to the rat nestin second intron, was that the human intron at E10.5 mediated lacZ expression also in early migrating neural crest cells, which is a site of endogenous nestin expression. In conclusion, these data show that a relatively short, evolutionarily conserved region is sufficient to control gene expression in CNS progenitor cells, but that the same region differs between rodents and primates in its capacity to control expression in neural crest cells.     

FasL启动子调控的报告基因表达质粒的构建及活性分析

目的扩增FasL启动子并构建带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒,并评价在皮质酮(啮齿类动物体内的糖皮质激素)作用的睾丸Leydig细胞中,由FasL启动子调控的荧光素酶的表达活性。本研究将为进一步分析Leydig细胞中FasL启动子转录调控的作用机制奠定基础。方法采用DNA重组技术构建由FasL启动子调控的荧光素酶报告基因的表达质粒。此重组质粒经阳离子脂质体LipofectAMINE介导,瞬时转染入Leydig细胞中,36h后细胞经皮质酮处理,并于48h时收集细胞。测定荧光素酶的相对表达活性。结果(1)酶切及测序证实成功扩增FasL基因启动子并构建了带有FasL基因启动子的报告基因表达质粒；(2)皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子调控的荧光素酶表达质粒的表达活性显著增高。结论构建成功的带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒可准确地评价FasL启动子在凋亡过程中的作用。     

Fate-Mapping of GM-CSF Expression Identifies a Discrete Subset of Inflammation-Driving T Helper Cells Regulated by Cytokines IL-23 and IL-1β

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雄激素应答元件陷阱DNA抑制PSA基因启动子的作用并诱导LNCaP细胞凋亡(英)

目的：研究雄激素应答元件陷阱DNA（ARE decoy）对前列腺特异抗原（PSA）基因启动子的抑制作用及其对前列腺癌细胞LNCaP细胞生长活性的影响，为前列腺癌的基因治疗寻求新的策略。 方法:联合运用报告基因和陷阱DNA策略，构建含PSA基因5’侧启动子区640 bp DNA的荧光素酶表达载体pGL3-PSA， ARE陷阱DNA共转染前列腺癌细胞株PC3-M。应用双荧光素酶测定系统，检测荧光素酶的表达活性。然后，应用2 mg/L ARE decoy转染LNCaP细胞，通过相差显微镜观察细胞超微结构变化，MTT比色法检测细胞生长活性，DNA ladder和流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡以研究ARE decoy DNA对前列腺癌细胞LNCaP细胞生长活性的影响。同时提取LNCaP细胞核蛋白，应用电泳迁移率变动分析(EMSA)检测ARE decoy DNA与雄激素受体的特异结合。结果:ARE decoy DNA显著抑制报告基因荧光素酶的表达，抑制率可达95%。EMSA显示ARE decoy DNA能特异与核蛋白中雄激素受体结合。LNCaP细胞转染ARE decoy DNA后，镜下观察部分细胞出现凋亡形态学的改变，细胞体外生长受到抑制，染色体DNA凝胶电泳可见明显梯形条带。转染48h的凋亡率为22.4%。 结论:实验表明ARE decoy DNA能竞争结合雄激素受体(AR)，阻断AR的作用而诱导LNCaP细胞凋亡，有可能为前列腺肿瘤的治疗提供新的策略。     

CARD In Situ Hybridization: Sights and Signals

During the last decade, several strategies have been developed to improve the detection sensitivity ofin situ hybridization (ISH) by amplification of either target nucleic acid sequences prior to ISH (e.g.,in situ PCR), or the detection signals after the hybridization procedures (signal amplification). Here we outline the principles of tyramide signal amplification using the catalyzed reporter deposition (CARD) technique, summarize applications as well as possible limitations of CARD ISH, and discuss some future directions ofin situ nucleic acid detection using this amplification strategy.     

1,25-二羟维生素D_3抑制报导载体pGL_2荧光素酶表达的研究

通过磷酸钙沉淀法将载体DNA转染Caco－2细胞。Caeo－2细胞经不同浓度1,25一二羟维生素D3处理后,测定表达的荧光素酶活性。结果;当pSG5－VDR表达载体共转染时1,25一二羟维生素D3显著地抑制Caco－2细胞荧光素酶的表达;而未使用pSG5－VDR表达载体共转染时,则无抑制作用。说明1,25一二羟维生素D3能抑制报导载体pGL2荧光素酶的表达。类似于人类PTH基因中的潜在抑制性VDRE存在于报导载体pGL2。     

维生素D_3对报告载体荧光素酶表达的作用

目的：　研究１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对结肠癌细胞系Ｃａｃｏ－２ 细胞中报告基因表达的作用,并探讨在报告载体ｐＧＬ２ 序列中存在潜在的抑制性维生素Ｄ应答元件（ＶＤＲＥ）的可能性。方法：　采用磷酸钙沉淀法将报告载体转染入Ｃａｃｏ－２ 细胞。Ｃａｃｏ－２细胞经不同浓度１,２５－二羟维生素Ｄ３ 处理后测定细胞裂解液中表达的荧光素酶活性。结果：　应用ｐＧＬ２ 报告载体时,当用ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染后,１,２５－二羟维生素Ｄ３显著地抑制Ｃａｃｏ－２ 细胞荧光素酶的表达（Ｐ＜ ０．０５）;而未使用该表达载体共转染则无抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）。应用ｐＧＬ３ 报告载体时,不同浓度的１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对ｐＬＧ３转染后Ｃａｃｏ－２ 细胞表达的荧光素酶活性均无显著抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）,该作用不依赖是否存在有ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染。结论：１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对报告载体ＰＧＬ２ 荧光素酶表达具有抑制作用,而对ｐＧＬ３ 则否;类似人类ＰＴＨ基因中的潜在抑制性ＶＤＲＥ存在于报告载体ｐＧＬ２,在ｐＧＬ３ 中该ＶＤＲＥ业已改变。     

基于雌激素应答元件转录调节的药物筛选模型的建立

目的 :建立靶向雌激素应答元件 (ERE)的药物筛选模型 ,为筛选雌激素受体 (ER)配体奠定基础。方法 :构建重组报告基因载体 pERE-TAL-SEAP ,与对照载体 pCMVβ瞬时共转染表达人ERα或ERβ的Hela细胞株 ,观察化合物对SEAP报告基因表达活性的影响。结果 :雌二醇 (E₂ )诱导表达人ERα或ERβ的Hela细胞株SEAP的表达 ,EC₅₀分别为 (80.5 8± 8.51) pmol·L^-1和 (10 3.90± 5.29) pmol·L^-1,最大效应浓度为 10nmol·L^-1;金雀黄素 (Gen)也诱导表达人ERα和ERβHela细胞株SEAP的表达 ,EC₅₀ 分别为 (39.38±2.26)nmol·L^-1和 (10.86±0 .75 )nmol·L^-1;最大效应浓度为 1μmol·L^-1;E₂ 和Gen诱导SEAP表达的最大水平较对照孔细胞高 7～ 14倍。ER拮抗剂ICI182 ,780可完全抑制E₂ 和Gen对SEAP的诱导作用。结论 :利用此模型检测化合物诱导报告基因的表达水平可筛选和发现ER配体。     

染料木黄酮、拟雌内酯及槲皮素对孕烷X受体介导的CYP3A4转录的调节作用

目的　研究植物雌激素中的染料木黄酮(GST)、拟雌内酯 (COM)及槲皮素 (QU)能否通过活化人孕烷X受体 (PXR)诱导CYP3A4的转录表达。方法用PXR依赖的瞬时转染报告基因试验检测 3种植物雌激素的诱导作用。结果　GST ,COM和QU均能通过活化PXR诱导HepG2 细胞CYP3A4基因的转录表达 ,最大诱导倍数 (相对于用浓度为 0 .1%的DMSO处理的细胞 )在本实验中分别为 11.97(P <0 .0 1) ,2 .98(P <0 .0 1)和 3.2 8(P <0 .0 1)。结论　GST ,COM和QU均能诱导CYP3A4的转录表达 ,其作用机制通过活化PXR。GST ,COM和QU的摄入可能影响其他CYP3A4底物尤其是药物在体内的代谢。