Vaccination inhibits the human adenoviral transduction in a mouse keratoconjunctivitis model

Adenovirus infections are a major cause of epidemic keratoconjunctivitis (EKC), which can lead to corneal subepithelial infiltrates and multifocal corneal opacity. In the current study, we investigated the use of an E1/E3-deleted adenovirus serotype 5 (Ad5) vector as a vaccine administered intramuscularly (IM) or intranasally (IN) against subsequent challenges with a luciferase-expressing Ad5 (Ad5-Luci) vector via eyedrop. We evaluated the adaptive immune response to Ad5 vector vaccination and confirmed a robust polyfunctional CD8 T cell response in splenic cells. Neutralizing Ad5 antibodies were also measured in the sera of vaccinated mice as well as Ad5 antibody in the eye wash solutions. Upon challenge with Ad5-Luci vector 8 weeks post the primary immunization, transduction was significantly reduced by > 70% in the vaccinated mice, which was slightly better in IM- vs. that in IN-vaccinated animals. Resistance to subsequent challenge was observed 10 months post primary IM vaccination, with sustained reduction up to 60% in the Ad5-Luci vector transduction. Passive immunization of naive mice with antisera from IM to vaccinated mice subsequently challenged with the Ad5-Luci vector resulted in approximately 40% loss in transduction efficiency. Furthermore, the mice that received IM immunization with or without CD8 T cell depletion showed > 40% and 70% reductions, respectively, in Ad8 genomic copies after Ad8 topical challenge. We conclude that Ad-vector vaccination successfully induced an adaptive immune response that prevented subsequent Ad transduction in the cornea and conjunctiva-associated tissues in a mouse model of adenovirus keratoconjunctivitis, and that both cellular and humoral immunity play an important role in preventing Ad transduction.     

T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA的方法

目的：建立一种应用T7 RNA聚合酶体外转录合成大量siRNA的方法。方法：以萤火虫荧光素酶为靶标，应用T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA，脂质体转染法将其导入HepG2细胞中，通过测定荧光素酶的量，评价siRNA对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制作用。结果：合成了以萤火虫荧光素酶为靶标的siRNA，合成的siRNA能特异性地抑制荧光素酶基因的表达，抑制率为80％。结论：建立了一种经济简便的体外合成siRNA的方法。     

基于荧光素酶生物发光检测方法的研究及其应用进展

生物发光现象广泛存在于自然界中,不管是在陆地或是海洋都有发光生物的踪迹。其中基于荧光素酶的生物发光系统被广泛研究,启发着人类在基因、表观遗传等方面进行探索,并且开发出一系列相关的检测方法,用于体内体外各方面研究。本文从生物发光系统、荧光素酶的种类以及荧光素酶生物发光检测方法的开发与应用这几个方面进行总结,简要概括近年来基于荧光素酶生物发光检测的研究进展。     

1,25-二羟维生素D_3抑制报导载体pGL_2荧光素酶表达的研究

通过磷酸钙沉淀法将载体DNA转染Caco－2细胞。Caeo－2细胞经不同浓度1,25一二羟维生素D3处理后,测定表达的荧光素酶活性。结果;当pSG5－VDR表达载体共转染时1,25一二羟维生素D3显著地抑制Caco－2细胞荧光素酶的表达;而未使用pSG5－VDR表达载体共转染时,则无抑制作用。说明1,25一二羟维生素D3能抑制报导载体pGL2荧光素酶的表达。类似于人类PTH基因中的潜在抑制性VDRE存在于报导载体pGL2。     

维生素D_3对报告载体荧光素酶表达的作用

目的：　研究１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对结肠癌细胞系Ｃａｃｏ－２ 细胞中报告基因表达的作用,并探讨在报告载体ｐＧＬ２ 序列中存在潜在的抑制性维生素Ｄ应答元件（ＶＤＲＥ）的可能性。方法：　采用磷酸钙沉淀法将报告载体转染入Ｃａｃｏ－２ 细胞。Ｃａｃｏ－２细胞经不同浓度１,２５－二羟维生素Ｄ３ 处理后测定细胞裂解液中表达的荧光素酶活性。结果：　应用ｐＧＬ２ 报告载体时,当用ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染后,１,２５－二羟维生素Ｄ３显著地抑制Ｃａｃｏ－２ 细胞荧光素酶的表达（Ｐ＜ ０．０５）;而未使用该表达载体共转染则无抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）。应用ｐＧＬ３ 报告载体时,不同浓度的１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对ｐＬＧ３转染后Ｃａｃｏ－２ 细胞表达的荧光素酶活性均无显著抑制作用（Ｐ＞ ０．０５）,该作用不依赖是否存在有ｐＳＧ５－ＶＤＲ表达载体共转染。结论：１,２５－二羟维生素Ｄ３ 对报告载体ＰＧＬ２ 荧光素酶表达具有抑制作用,而对ｐＧＬ３ 则否;类似人类ＰＴＨ基因中的潜在抑制性ＶＤＲＥ存在于报告载体ｐＧＬ２,在ｐＧＬ３ 中该ＶＤＲＥ业已改变。     

NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定

目的 :对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophilgelatinase associatedlipocalin ,NGAL)基因 5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定。方法 :以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因 5′侧翼区 ( -14 3 1～ +84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用。结果 :在NGAL基因 5′端 -945～ -65 8和 -65 7～ -4 172个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用 ,而在 -4 16～ -15 2区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用。结论 :在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着 2个转录增强子元件和 1个转录沉默子元件     

基于GADD153启动子的环境致癌物快速筛选系统研究

[目的]构建快速检测环境中痕量致癌物DNA损伤效应的重组人肝细胞株。[方法]构建含生长抑制与DNA损伤基因153(GADD153)启动子和萤光素酶报告基因的重组稳定转染人肝肿瘤HepG2细胞;发光检测不同致癌物对稳定转染细胞的DNA损伤效应;同时RT-PCR检测内源性GADD153mRNA的表达;彗星试验(Cometassay)检测DNA的损伤效应。[结果]稳定转染GADD153-LUC细胞株可检出多环芳烃、芳香胺、重金属、农药等已知环境致癌物以及实际水样中的含量。检测结果与彗星试验结果相比,大多数检测下限均低于彗星试验的检测限,其中对苯并芘、氯化镉和2-氨基芴的检测灵敏度分别高于彗星试验1000、300和100倍;对Aems试验不敏感的重金属、四氯化碳、氟化钠等重组细胞株具有较高的检测灵敏性。10μmol/L的氯化镉可诱导内源性GADD153mRNA和萤光素酶活性表达增加,相关分析表明两者具有良好的相关性(r2=0.9539)。[结论]重组细胞株GADD153-LUC细胞可快速检测环境中痕量污染物的DNA损伤效应。