“益精方”提高小鼠精子特异性钙通道蛋白1及胞内Ca2+浓度的表达

目的 研究以“益精方”为代表的中药对小鼠精子尾部特异性钙通道蛋白(cation channel 1 of sperm,CatSper1)及其胞内Ca2+浓度的影响.方法 将60只成年雄性昆明小鼠用分层法随机分为大剂量中药治疗组(large dose,LD)、小剂量中药治疗组(small dose,SD)、模型组(model group,MG)和对照组(control group,CG),按60 mg/kg体质量给MG、SD、LD组小鼠腹腔注射环磷酰胺,给CG组小鼠腹腔注射生理盐水,1次/d,连续5d,第6天开始按体质量分别给SD和LD组小鼠灌服“益精方”,剂量分别为人类常规用量(以60 kg为标准)的1倍和5倍,MG组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃,1次饵,连续34 d,CG组小鼠常规饲养,然后对小鼠进行精液常规分析,并用RT-PCR法检测小鼠精子CatSper1的表达,流式细胞术检测精子胞内Ca2+浓度.结果 经“益精方”治疗后,LD组精子密度、前向运动精子百分率、精子活动率明显增加,与MG组比较有统计学意义(P＜0.05);MG组小鼠精子密度,前向运动精子百分率,精子活动率显著低于CG组(P＜0.05);MG组小鼠精子CatSper1的表达量虽然下降,但与CG组比较没有明显区别,治疗后LD组显著高于MG组(P＜0.05),而与CG组比较没有明显区别;MG组小鼠精子胞内Ca2+浓度明显减少,与CG组小鼠比较有统计学意义(P＜0.05),而治疗后LD组小鼠胞内Ca2+浓度显著改善,与MG组小鼠比较有统计学意义(P＜0.05).结论 环磷酰胺腹腔注射可降低小鼠前向运动精子百分率、精子总活动率和精子密度,降低CatSper1表达量,大剂量“益精方”通过增加精子尾部CatSper1的表达,提高精子胞内Ca2+浓度,进而增加精子前向运动率和活动率,并可以增加小鼠精子密度,从而达到治疗少弱精子症的目的.     

真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的 构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列. 方法 利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中.生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列. 结果 成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段（2,061 bp）,并构建到pEGFP-N1表达载体中.三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3＇端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化. 结论 在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考.     

CatSperl在小鼠睾丸发育过程中的动态表达及与人精子活力的关系

目的 研究CatSper1 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化，并探讨CatSper1蛋白表达与精子运动的关系。方法 采用荧光实时逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）相对定量法检测CatSper1mRNA在出生后11、15、18、21、25、28、35、42、56和120d龄C57BL／6小鼠（每天龄3只）睾丸中的表达；分别从4例正常精液标本中用四层密度梯度Percoll（浓度分别为95％、76％、57％和47．5％）离心分离出高活力和低活力精子，用于Western Blot定量检测CatSper1蛋白的表达。结果CatSper1mRNA在18d龄小鼠睾丸开始表达，在25和28d龄表达上调明显，分别为21d龄表达水平的2．95和7．59倍。自42d后上调缓慢，至成年小鼠时达到最高水平。CatSper1蛋白在每例标本高活力精子中的表达量均显著高于低活力精子（P〈0．05）。结论 CatSper1与精子活力特性有关，为进一步研究CatSper家族各成员间的关系和确切功能提供参考依据。