siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响

目的探讨跨膜转运蛋白21（TMP21）对γ分泌酶活性的影响。 方法将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF（KO）]分为转染组（T）和对照组（C），转染组转染载有TMP21小分子干扰RNA（siRNA）的质粒，对照组转染空质粒。每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品（T1、C1），经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品（T2、C2），用γ分泌酶组分早老蛋白1（PS-1）特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品（IPT2、IPC2）。蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP21、PS-1和Nicastrin（NCT）蛋白表达量；应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β＆#61472;淀粉样肽42的生成总量。 结果蛋白质印迹法检测显示，TMP21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为（5294±247）ng/ml，在对照组样品IPC2中为（19110±579）ng/ml，组间差异有统计学意义（P〈0.05）；各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化；TMP21可与PS-1共沉降。ELISA法检测显示，转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为（348±18）pg/ml，对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为（342±18）pg/ml，组间差异有统计学意义（P〈0.01）。 结论TMP21可能为γ分泌酶的组分之一。在TMP21蛋白低表达状态下γ分泌酶活性升高，提示TMP21为γ分泌酶的负调控因子之一。     

钙调神经磷酸酶在大鼠不同组织中的分布及活性

目的:观察钙调神经磷酸酶(CaN)在大鼠不同器官组织中的活性和蛋白分布。方法:取正常大鼠不同器官组织,应用Westernblot及免疫组织化学方法测定CaN催化亚单位α亚型(CnAα)在各组织中的蛋白含量及分布,并用[³²P]标记的底物肽测定各组织的CaN活性。结果:①Westernblot结果显示,CnAα在大鼠脑组织中有丰富表达,心脏、骨骼肌和肺中亦有表达,但肾脏及主动脉未检测出有CnAα表达。②免疫组织化学显示,大鼠脑组织、心肌细胞胞浆内、肺内巨噬细胞及细支气管周围的结缔组织、主动脉外膜、肾小血管周围结缔组织及肾远曲小管及集合管的外壁中存在免疫反应阳性产物。③CaN活性在脑组织最高,其次为骨骼肌、心肌和肺组织,主动脉和肾脏最低。结论:钙调神经磷酸酶在体内具有广泛分布,可能参与多种器官组织的功能调节。     

不同转移潜能人肝癌细胞系酪氨酸磷酸化蛋白质差异分析

目的研究不同转移潜能人肝癌细胞系中酪氨酸磷酸化蛋白质表达的差异并筛查与肝癌转移相关的酪氨酸磷酸化蛋白质分子。方法应用双电泳(2-D E)、免疫印迹法及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析,对三种不同转移潜能人肝癌细胞系Hep 3B、MHCC97L和MHCC97H进行酪氨酸磷酸化蛋白质组分析。结果对照2-DE胶和免疫印迹发光胶片,Hep3B检测到10个点,MHCC 9 7L检测到19个点, MHCC97H检测到17个点。经质谱鉴定,得到膜连蛋白Ⅰ等19个差异点。结论细胞内酪氨酸磷酸化蛋白的表达差异与肝癌的侵袭转移有关。     

心脏过表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型的建立

目的 建立心脏过表达人源PRKAG2 (G100S)的转基因小鼠模型,为进一步研究该人源基因点突变对小鼠心脏发育、形态和功能维持的作用奠定基础.方法 克隆人源基因PRKAG2并构建点突变质粒,将人源PRKAG2 (G100S)插入α肌球蛋白重链(α-MHC)启动子下游,构建转基因表达载体.选用C57BL/6J小鼠为遗传背景,通过显微注射法建立人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型.采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测人源PRKAG2 (G100S)的表达.结果 经过回交繁育后建立了2个品系的心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)的转基因小鼠品系F2代,并通过qPCR、蛋白质印迹法检测,确认了转基因小鼠心脏组织中人源PRKAG2(G100S)在rmRNA和蛋白水平存在过表达,且该突变能在转基因小鼠中稳定传代.结论 本研究成功建立了心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,人源PRKAG2 (Gl00S)基因在心脏组织的过度表达在小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步深入研究与探讨.     

基于CD133及上皮 间质转化相关因子的列线图模型对上皮性卵巢癌预后的预测价值

目的 构建预测上皮性卵巢癌(EOC)预后的列线图模型,验证其应用价值。方法 对2009年1月至2012年1月十堰市太和医院152例经手术病理确诊的初治EOC病人进行术后持续随访。检测其病理标本中CD133、Snail、E-cadherin蛋白表达情况,统计病人一般资料及临床病理资料,通过Cox风险比例模型确定病人累积生存率的影响因素,应用R语言建立基于上述因素的列线图模型,并验证其应用价值。结果 152份病理标本中,CD133阳性表达87例,占57.24%,E-cadherin阳性表达50例,占32.89%,Snail阳性表达89例,占58.55%。CD133、Snail阳性者及E-cadherin阴性者,累积生存时间明显短于对应对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。CD133阳性、伴腹部脏器或淋巴结转移是病人预后的危险因素,E-cadherin阳性是病人预后的保护因素(P＜0.05)。经R语言建立列线图模型及校准曲线,校准图形接近于斜率为1的直线,列线图模型的内部一致性参数C-index=0.699。结论 CD133及E-cadherin表达情况是EOC病人预后的影响因素,构建列线图能够有效预测病人生存率。     

急性冠状动脉综合征患者血清基质金属蛋白酶2水平的检测

目的检测急性冠状动脉综合征患者血清基质金属蛋白酶2的水平,探讨其与不稳定性斑块及临床危险度的内在联系。方法应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western免疫印迹法分别检测急性冠状动脉综合症患者血清基质金属蛋白酶2的水平。其中不稳定型心绞痛组28例,分属低、中、高危3个亚组,急性心肌梗死组50例,正常对照组50例,稳定型心绞痛组51例。结果对照组、稳定型心绞痛组、不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组基质金属蛋白酶2水平分别为236±33 INT.mm2、224±23 INT.mm2、455±51 INT.mm2和503±45 INT.mm2。急性心肌梗死组和不稳定型心绞痛组分别与稳定型心绞痛组和对照组之间比较,基质金属蛋白酶2水平差异有显著性,对照组与稳定型心绞痛组之间基质金属蛋白酶2水平无统计学差异。4组之间血清基质金属蛋白酶原水平无明显差别。Western免疫印迹法也显示了类似的结果。不稳定型心绞痛低危、中危、高危3个亚组间比较,无论是酶原还是活性酶的水平均未发现显著差别。结论血清基质金属蛋白酶2水平在急性冠状动脉综合征患者中明显升高,提示血清基质金属蛋白酶2增高可作为急性冠状动脉综合症的一个危险信号,但基质金属蛋白酶2与急性冠状动脉综合症危险度并无相关性。     

Nucleostemin在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达及其意义

背景：Nucleosterain（NS）是一个与细胞增殖相关的核蛋白,部分研究显示其仅高表达于干细胞和肿瘤细胞,成体组织分化细胞中未见NS表达。目的：探讨NS在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达及其意义。方法：收集38例结直肠癌患者的癌组织及其相应癌旁正常组织标本．以实时RT—PCR和蛋白质印迹法检测NSmRNA和蛋白表达。结果：实时PCR扩增曲线显示结直肠癌组织和正常结直肠组织均有NS基因指数式扩增,癌组织NSmRNA表达量显著高于正常组织（1．8939±0．9529对1．P=0．011）。蛋白质印迹法证实NS蛋白在正常组织中表达较微弱或几乎无表达,癌组织中其表达显著增高（1．5397±0．3625对0．6336±0．3443,P=0．001）。结论：结直肠癌组织和正常结直肠组织中均存在NS基因．推测其微量表达可调节细胞正常增殖．而异常高表达则可通过某些机制促进细胞恶性增殖。     

癌基因双微体-2在多发性骨髓瘤中的表达及其临床意义

目的探讨癌基因双微体．2（MDM2）在多发性骨髓瘤（MM）中的表达及其临床意义。方法选取2008年7月至2010年6月温州市第二人民医院血液内科MM患者37例,另选5例巨球蛋白血症患者作为疾病对照组,5名骨髓捐献志愿者为健康对照组。应用逆转录聚合酶链式扩增反应和免疫印迹法分别检测各组MDM2mRNA及其蛋白变化。MM患者按国际分期系统将其分为I期11例,Ⅱ期18例,Ⅲ期20例,应用回归分析法观察MDM2mRNA及其蛋白表达与各分期的相关性。结果MDM2mRNA及其蛋白在健康对照组表达水平均很低,在疾病对照组表达水平稍高,在MM组则明显表现为过表达∽均〈0．05）。另外,MDM2mRNA及其蛋白表达与MM分期呈正相关（r值分别为0．782、0．821）。结论MDM2基因在MM患者中呈高水平表达,且与MM的临床分期有密切关系,临床上或可作为判断其预后和检测肿瘤微小残留的一个指标     

机械应力下成骨细胞外信号调节激酶ERK1/2的早期变化

目的:观察体外培养的成骨样细胞在不同机械应力下细胞外信号调节激酶ERK1/2的表达变化.方法:采用四点弯曲细胞力学加载装置系统,对人成骨样细胞进行加力:频率0.5 Hz,加力板变形量4000μstrain,按5,15,30 min和1h不同时间段,使细胞发生单轴牵张和压缩应变.运用Western Blot检测不同方向、不同作用时间的应力应变下细胞外信号调节激酶ERK1/2所产生的变化.结果:在4000μstrain的周期性应力作用时,细胞外信号调节激酶ERK1/2在5 min内被迅速激活,磷酸化程度大幅升高,牵张及压缩应力均有类似表现;1 h左右恢复至基态水平.牵张应力所引发的ERK磷酸化较压缩应力更强,其差异有统计学意义(P＜0.05).结论:较大的应力应变可以在早期激活成骨细胞内的MAPK/ERK信号转导通路,牵张应力所产生的效应较压缩应力更为明显,机械应力参与了细胞外信号调节激酶的活化.     

p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷酸化及其意义

目的:观探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化及其意义.方法:采用升高眼内压的方法,制作实验性视网膜缺血再灌注大鼠模型.将30只Wistar大鼠随机分为正常组(n=6)和缺血再灌注组(n=24),其中缺血再灌注组又分为再灌注后2,12,24,72 h等4个时间段(每时间段6只).应用Western Blot法检测视网膜组织中p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK (p-p38 MAPK)蛋白的表达变化.结果:p38 MAPK在缺血再灌注组各时间点的视网膜组织内的表达保持相对恒定,与正常对照组相比无统计学上的变化(P＞0.05).p-p38 MAPK的表达水平在缺血再灌注组12 h时即有明显升高,24 h时达到高峰,72 h时仍维持较高的表达水平,与正常对照组相比有统计学著差异(P＜0.01).结论:p38 MAPK信号通路的激活可能与缺血再灌注所造成的视网膜损伤有密切关系.