Apak的亚细胞定位机制研究

目的探讨P53的调控分子Apak亚细胞定位的结构基础。方法在热休克及DNA损伤诱导剂MMS处理下,通过免疫荧光技术观察Apak的亚细胞定位变化,并通过激光共聚焦荧光显微镜观察Apak截短体的亚细胞定位。结果 Apak多以均匀的形式分布在细胞核质,偶见在核仁中聚集;在外界刺激后Apak核内的均匀分布减少,主要以点状的大颗粒形式在核仁中呈聚集样分布;Apak的9种截短体均可定位于核内,且在核质和核仁中具有明显的比例差异。结论在DNA损伤信号下Apak有一个从核质向核仁移位的动态过程;KRAB区可以拮抗Apak在核仁的定位,而锌指尤其是锌指数的数目（锌指数〉14）则决定了Apak能否在核仁定位。     

Apak对p53R175H的调控研究

目的 探讨Kruppel相关盒(KRAB)型锌指蛋白Apak对p53R175H的调节功能及机制.方法 报告基因检测Apak对p53R175H的活性调控,实时定量PCR检测Apak对p53R175H下游靶基因的转录水平的调控能力,Western印迹实验检测蛋白的表达.结果 Apak抑制p53175H的转录活性功能与抑制野生型p53(wtp53)的转录活性功能相比被大大减弱,Apak能够下调wtp53相关凋亡基因的水平,而在转染了p53R175H的细胞中,Apak的这种下调功能几乎丧失.结论 Apak对突变型p53R175H失去调控能力.     

Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化

目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。     

Apak的组织表达谱及其白血病相关性分析

目的探讨P53负调控蛋白Apak的组织分布特征并分析其白血病相关性。方法利用组织斑点杂交分析Apak在多种组织中的分布情况,Northern杂交分析其在5种白血病细胞系的转录,并用RT-PCR分析Apak在32例白血病患者和12例健康人外周血中的mRNA水平。结果 Apak的组织表达谱分析表明该基因只在胎肝、胎脾以及成人唾液腺、膀胱、左右心室和心尖中高表达。在多种白血病细胞系Jurkat,AHH-1,MOLT-4,SKO-007和HL-60和部分白血病患者的外周血中Apak也呈现高转录,提示Apak在白血病发生中可能发挥重要功能。结论本研究揭示了Apak是一种具有组织特异性分布的P53负调节蛋白,其在白血病中的高表达提示其可能与该病的发生有一定的关联。     

低氧状态下Apak对rRNA转录的调控

目的 探讨低氧状态下Kruppel相关盒(KRAB)型锌指蛋白Apak对核糖体RNA(rRNA)转录影响变化及机制.方法 利用实时定量PCR检测低氧状态下rRNA转录水平的变化及Apak对rRNA转录水平的影响,Western印迹检测蛋白的表达,间接免疫荧光观察低氧状态下Apak的定位变化.结果 在低氧(0.3%O2)处理24 h内,野生型HCT116细胞rRNA表达水平呈现先高后低的变化,而在Apak敲除的HCT116细胞系中,低氧处理后rRNA转录水平持续下降;低氧处理3 h后,Apak对rRNA转录的抑制能力消失,Apak的蛋白水平和磷酸化水平降低,在细胞核仁中的定位消失.结论 低氧处理后Apak对rRNA转录抑制能力的消失促使rRNA转录水平的暂时升高.