Macroporous thin membranes for cell transplant in regenerative medicine

The aim of this paper is to present a method to produce macroporous thin membranes made of poly (ethyl acrylate-co-hydroxyethyl acrylate) copolymer network with varying cross-linking density for cell transplantation and prosthesis fabrication. The manufacture process is based on template techniques and anisotropic pore collapse. Pore collapse was produced by swelling the membrane in acetone and subsequently drying and changing the solvent by water to produce 100 microns thick porous membranes. These very thin membranes are porous enough to hold cells to be transplanted to the organism or to be colonized by ingrowth from neighboring tissues in the organism, and they present sufficient tearing stress to be sutured with surgical thread. The obtained pore morphology was observed by Scanning Electron Microscope, and confocal laser microscopy. Mechanical properties were characterized by stress–strain experiments in tension and tearing strength measurements. Morphology and mechanical properties were related to the different initial thickness of the scaffold and the cross-linking density of the polymer network. Seeding efficiency and proliferation of mesenchymal stem cells inside the pore structure were determined at 2 h, 1, 7, 14 and 21 days from seeding.     

脂肪来源间充质干细胞对大鼠肝移植的免疫调节作用

目的探讨大鼠脂肪来源间充质干细胞(MSC)对大鼠肝移植术后急性排斥反应的作用。方法分离、培养SD大鼠MSC,体外混合淋巴细胞培养(MLC)体系中,研究MSC对Wistar大鼠T细胞增殖的抑制作用。以SD与Wistar大鼠为供受体建立肝移植模型。随机分为MSC处理组与空白对照组,术后第7天检测肝功能、血清白细胞介素(IL)-2和白细胞介素(IL)-10水平、肝组织病理形态及肝细胞凋亡。结果体外MLC中,Wistar大鼠T细胞增殖明显受抑,抑制率为48.44%。实验组血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、IL-2、IL-10分别为(134.2±45.0)、(162.5±30.5)U/L、(30.6±5.4)μmol/L、(187.35±18.26)、(193.95±37.62)μg/L;对照组上述指标分别为(355.6±54.3)、(296.4±71.2)U/L、(145.7±28.6)μmoL/L、(295.73±57.15)、(75.12±11.23)μg/L,两组差异有统计学意义(P<0.05);病检提示实验组排斥反应较对照组明显减轻;脱氧脲核苷酸缺口末端标记(TUNEL)检测提示实验组肝细胞凋亡程度明显低于对照组(P<0.05)。结论供体来源MSC能明显抑制MLC体系中受体源T细胞的增殖,并能显著减轻大鼠肝移植术后急性排斥反应。     

AdEasy1／Cbfa1诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的：观察核心结合因子a1（Cbfa1）对兔骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的诱导作用。方法：体外分离培养兔骨髓MSCs，用AdEasy1／Cbfa1。转染MSCs，在转染后3d,1、2、3和4周时，组织化学和免疫组化等方法检测成骨标志碱性磷酸酶和骨钙素的表达。结果：AdEasy1／Cbfa1转染后的兔骨髓MSCs表现出与成骨细胞相似的形态，并且表达碱性磷酸酶和骨钙素。结论：Cbfa1可诱导兔骨髓MSCs向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞转染人TH基因的实验研究

目的评价酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因修饰骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)后TH的表达情况及转染TH基因对MSCs的影响.方法构建含人TH基因的pCMV/hTH质粒,用脂质体转染原代培养的大鼠MSCs;Western blot及免疫细胞化学染色鉴定TH基因的表达及MSCs的分化情况;MTT比色法测定转染后的MSCs细胞活性,并与未转染的MSCs进行细胞活性比较.结果构建的pCMV/hTH质粒经ECoRI酶切后产生1.9okb和5.3kb的片段,与回收的目的基因及载体基因片段大小相符;转基因后的MSCs Western blot及免疫细胞化学染色显示TH染色阳性;转染后MSCs未见有NeuN,GFAP的表达;MTT比色法测定细胞活性,未转染与转染者差异无显著性.结论构建的TH基因能在体外培养的鼠MSCs中较好的表达,转染不会诱导MSCs向神经样细胞分化,对MSCs细胞活性无明显影响.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为雪旺样细胞的方法

目的 :建立人骨髓间充质干细胞体外向雪旺样细胞定向诱导分化的方法。方法 :取健康人骨髓血标本 ,利用percoll(密度为 1.0 73 g·ml-1)分离骨髓单个核细胞 ,在DMEM LG + 10 % (体积分数 )FBS中培养 ,通过流式细胞术对培养细胞进行表型测定 ,对第 2、3、5、8代间充质干细胞进行定向诱导分化 ,用单抗S 10 0、神经胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillargacidicprotein ,GFAP) ,通过免疫组化方法对诱导的细胞进行鉴定。 结果 :经 percoll分离的间充质干细胞可传 16代 ,细胞数增加了大约 6× 10 7倍。流式细胞术结果显示 :percoll分离出来的未经培养的细胞 ,其CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 3 2 .4 7%± 3 .4 9% ,而培养后贴壁细胞中CD2 9+CD4 4 +CD3 4 -CD4 5 -细胞数为 94 .3 8%± 1.5 0 %。诱导后免疫组化染色结果显示 :由 β ME +bFGF预诱导、β ME +bFGF诱导的S 10 0阳性细胞最多 ,可达 90 %± 4 % ,GFAP阳性细胞为 2 1%± 5 %。结论 :人骨髓中间充质干细胞能定向诱导分化成雪旺样细胞。     

腺病毒介导的NT-3基因在骨髓间质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒介导的NT-3基因在培养的大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达.方法:在293细胞中培养扩增NT-3重组腺病毒(adenovirus vector for NT-3,Ad-NT-3),测定病毒滴度,然后用Ad-NT-3感染传代培养的MSCs,RT-PCR技术检测NT-3基因的表达.结果:Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒,MSCs经Ad-NT-3感染后有NT-3 mRNA的转录.结论:腺病毒介导的NT-3基因可转入培养的MSCs并高效表达,为NT-3基因治疗的研究奠定了基础.     

大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

Nurr1基因转染人脐血间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究

目的探讨外源性Nurrl基因修饰的人脐血间充质干细胞在基因重组成纤维细胞生长因子-8(FGF8)和音猬因子(Shh)诱导下体外分化为多巴胺能神经元的情况。方法间充质干细胞被随机分为A组(对照组)、B组(Nurrl组)、C组(FGF8+Shh组)及D组(Nurrl+FGF8+Shh),采用脂质体法将pcDNA3.1-Ntrr1转染B、D组间充质干细胞,Western blot观察Nurr1基因表达情况,并在神经元条件培养液中进行增殖培养和诱导分化,间接免疫荧光染色法鉴定细胞性质,高效液相色谱法测定多巴胺含量。结果Western blot结果显示转染后Nurr1蛋白表达明显增高。A组和B组未发现酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞,而C组和D组TH阳性细胞分别为10．12％±2．65％及25．36％±3．13％,多巴胺含量分别为(43．6±2．1)nmol／L及(83．2±3．5)nmol／L,差异均有显著性意义(P< 0．01)。结论人脐血间充质干细胞在FGF8和Shh诱导下可以分化为多巴胺能神经元,外源性Nurr1基因修饰后,分化为多巴胺能神经元的数量增加。     

脐血来源的间充质干细胞生物学特性与向成骨细胞分化能力的研究

目的研究人脐血来源的间充质干细胞（UCBMSC）的免疫表型、生物学特性及其向成骨细胞分化的能力。方法分离脐血单个核细胞，以干细胞培养液培养间充质干细胞（MSC），观察其体外生长特性；用流式细胞术进行免疫表型测定和细胞周期分析；以含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的诱导液定向诱导向成骨细胞分化；以碱性磷酸酶染色、矿化结节染色、骨桥蛋白mRNA的表达以及I型胶原表达鉴定MSC向成骨细胞分化的潜能。结果从脐血中可以培养出MSC，为成纤维细胞样的贴壁细胞。免疫表型分析显示CD45、CD34、CD11a、CD14、HLA．DR阳性细胞占1％～3％；CD166、CD44、CD106、CD29、CD105、CD49e、CD90、CD73表达率达91％～98％。细胞周期分析显示95％以上的细胞处于G0／G1期。定向成骨细胞诱导后，可以检测到碱性磷酸酶、I型胶原的表达，矿化结节的形成和骨桥蛋白mRNA的表达。结论UCBMSC是基质细胞的祖细胞，在合适的条件下可被诱导向成骨细胞分化，因此有可能作为有潜力的骨组织工程的种子细胞来源。