脂肪干细胞移植治疗化疗导致的口腔黏膜炎的初步观察

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)移植治疗化疗导致的口腔黏膜炎的效果。方法 将10只金黄地鼠随机分为2组,制备化疗性金黄地鼠口腔黏膜炎模型,实验组(M组)于金黄地鼠口腔颊囊溃疡周边局部多点注射被标记的ADSCs+PBS细胞混悬液;对照组(N组)于相同部位注射等体积PBS。每天观察记录金黄地鼠口腔黏膜情况,比较实验组和对照组颊囊粘膜愈合情况。分别于实验第9天、第14天处死实验动物,制备组织标本,行大体观察、HE染色、冰冻切片、荧光显微镜下观察。利用SAS软件对数据进行分析。结果 大体观察及组织学染色显示M组黏膜愈合程度及质量明显优于N组;荧光显微镜观察显示移植一周后CM-Dil染色的ADSCs能在该部位定居且存活良好。结论 脂肪干细胞移植对口腔黏膜溃疡具有一定的促愈作用,可以快速治疗化疗导致的口腔黏膜炎。     

EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究

目的:应用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和CM-Dil标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化和转归.方法:分别用EGFP慢病毒表达和CM-Dil染料的方法标记比格犬骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),MTT法检测标记细胞的体外增殖能力.BMSCs接种珊瑚支架体外成骨诱导7天后,将未标记组、EGFP组和CM-Dil组分别植入裸鼠背部皮下,空白支架作为阴性对照.术后4、8、12周取材,HE染色观察成骨情况,EGFP组采用GFP免疫组化、CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪BMSCs在体内的变化.结果:两种标记技术能高效标记BMSCs,标记前后细胞的体外增殖无显著性差异(P>0.05).细胞-支架复合物植入体内12周后有新生骨形成,标记细胞数量随时间延长而逐渐减少,12周后仍显示有部分标记细胞存活.结论:EGFP和CM-Dil可用于示踪组织工程种子细胞,通过示踪说明BMSCs在体内组织工程骨成骨过程中发挥了重要作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及荧光标记的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增、荧光标记骨髓间充质干细胞的方法,为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用荧光活性杂料CM-Dil标记。结果分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;CM-Dil标记后,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后呈红色荧光,DIL标记阳性率为100%,标记的骨髓MSCs呈梭形,保持了良好的形。结论采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,以获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效使用可行的方法;CM-Dil是一种简洁、有效的标记骨髓MSCs的方法。     

CM-Dil标记肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞实验研究

目的 探讨建立CM-Dil荧光标记的肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞的方法.方法 Wistar大鼠16只,四氯化碳皮下注射建立肝纤维化大鼠模型,分离培养肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞,分为实验组和对照组,实验组采用CM-Dil荧光进行标记内皮组细胞,对照组未进行标记.采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪检测CM-Dil荧光标记率,观察2组细胞生长状态和细胞动力学.结果 实验组CM-Dil标记的细胞呈红色荧光,标记阳性率为96.95％;实验组细胞生长状态良好,与对照组比较,生长曲线无明显改变.结论 CM-Dil可在体外成功标记肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞.     

CM-Dil体外标记人脐带间充质干细胞传代示踪的可行性

背景: 掌握人脐带间充质干细胞的移植示踪方法是研究其生物学特性的关键.目的: 观察用CM-Dil标记人脐带间充质干细胞及在体外传代示踪的可行性.方法: 采用酶消化法体外分离培养人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期、体外成脂成骨诱导鉴定该细胞.将第5代细胞用CM-Dil标记,并将细胞传代,荧光显微镜观察体外标记情况.结果与结论: 第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34、CD40;有80%以上的细胞处在G0/G1期,成脂成骨诱导后,油红O染色和碱性磷酸酶染色分别阳性.CM-Dil标记人脐带间充质干细胞细胞标记率达90%以上,体外传代后荧光强度逐渐减退,传8代后,荧光基本消失.说明人脐带间充质干细胞增殖、分化能力强,CM-Dil标记细胞示踪方法简单易行.     

人脐带间质干细胞的CM-Dil标记及其移植在急性肾损伤大鼠体内的示踪研究

目的:探讨人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)用CM-Dil染料标记之后生物学特性及体内定位示踪情况。方法:采用脐带组织块贴壁培养法分离人脐带间质干细胞,用CM-Dil染料标记第3代hucMSCs;采用细胞计数法分析CM-Dil标记后hucMSCs的生长变化情况;通过活体成像仪观察CM-Dil染料标记的hucMSCs移植于急性肾损伤大鼠后的体内定位。结果:CM-Dil染料标记hucMSCs的效率很高;标记后的hucMSCs生长增殖能力没有发生明显变化;体内示踪可以观察到标记的hucMSCs。结论:CM-Dil标记不影响hucM-SCs的生长增殖特征,并且能够在体内示踪,为后续研究提供了实验基础。     

RhoA基因沉默联合脐带间充质干细胞移植脑损伤大鼠功能的恢复

背景：研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷,对神经修复具有抑制作用。目的：脐带间充质干细胞移植同时联合RNAi介导的RhoA基因沉默,观察两者对脑损伤大鼠恢复的影响。方法：健康Wistar大鼠84只,采用液压颅脑损伤仪,给予253.3125-303.975kPa液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤模型,随机分成为对照组,脐带间充质干细胞移植组,联合组（脐带间充质干细胞移植联合RhoA基因沉默）。CM-Dil标记的脐带间充质干细胞移植后采用改良神经功能损伤评分系统（mNSS）评价大鼠神经功能恢复情况,在创伤性脑损伤后21-28d进行Morris水迷宫试验。4周后处死并行全脑冷冻切片苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察CM-Dil标记的脐带间充质干细胞的存活和分布情况,采用RT-PCR检测各组损伤区脑组织RhoA基因的表达量。结果与结论：移植后1,2,3,4周,大鼠神经学缺损评分脐带间充质干细胞移植组低于对照组（P〈0.05）,联合组明显低于对照组（P〈0.01）。Morris水迷宫试验各组平均逃避潜伏期均逐渐缩短,联合组3-5d时平均潜伏时间较脐带间充质干细胞移植组缩短（P〈0.05）,较对照组明显缩短（P〈0.01）;联合组穿越平台次数及在目标象限游泳距离与总距离百分比均高于对照组和脐带间充质干细胞移植组（P〈0.05）。移植4周后,脑组织冰冻切片和苏木精-伊红染色切片中的神经元数量和CM-Dil阳性细胞数联合组多于脐带间充质干细胞移植组,脐带间充质干细胞移植组多于对照组（P〈0.05）;联合组RhoAmRNA表达水平较对照组和脐带间充质干细胞移植组显著降低（P〈0.05）。提示脐带间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用RhoA基因沉默有协同效果。     

氯甲基苯甲酰氨荧光染料标记大鼠骨髓间质干细胞的体内示踪

背景：目前广泛应用于骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法，但标记与固定程序复杂，操作繁琐，易出现偏差。氯甲基苯甲酰氨（Chloromethyl—benzamidodialkylcarbocyanine，CM-Dil）是亲脂性膜荧光染料，能够与含有肽和蛋白质的硫氢基结合进而标记整个细胞。目的：探讨CM—Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性。设计、时间及地点：体内外细胞学观察，于2007—05／12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成。材料：SPF级Wistar大鼠40只，由中山大学实验动物中心提供。CM—Dil为美国Sigma公司产品。方法：在体外，以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组，以未标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为对照组，比较两组细胞生长与增殖情况，MTT法检测细胞生长增殖情况。在体内，分别将标记CM—Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养，于移植后第7，15，21，30天制备肝脏切片。主要观察指标：骨髓间质干细胞CM—Dil标记率，标记细胞在肝内定植、生长与分布。结果：体外培养结果显示，两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似，在绿色光激发下，CM—Dil发出红色荧光，24h后细胞标记率为100％，21d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭。体内实验中，经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质，呈椭圆形或不规则形的分化细胞；肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈“贴壁生长”，为椭圆形分化细胞，未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内；CM—Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21d。结论：CM—Dil染色简单、方便、稳定，荧光开始淬灭时间较长，可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子和CM-DiI荧光双标记骨髓间充质干细胞

背景:细胞移植疗效监测取决于有效的标记方法,从而能够对移植细胞进行示踪.超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide,SPIO)是一种较为理想的新型磁共振对比剂,用SPIO标记细胞可实现对移植细胞进行活体示踪.而荧光活性染料CM-Dil无细胞毒性,不影响细胞的生长,适合标记和示踪细胞.目的:观察SPIO及CM-Dil对骨髓间充质干细胞的标记及示踪效果.方法:全骨髓法培养猪骨髓间充质干细胞,用含50 mg/L铁浓度的SPIO及CM-Dil标记骨髓间充质干细胞,将双标后的骨髓间充质干细胞经冠状动脉注入猪心肌梗死模型.4周后取心脏组织行冰冻切片观察.结果与结论:SPIO及CM-Dil在体外标记骨髓间充质干细胞效率高,几乎达100%.经冠状动脉移植4周后心肌组织可找到双标记的骨髓间充质干细胞,结果提示SPIO及CM-Dil双标记骨髓间充质干细胞体内示踪效果好.     

牙龈间充质干细胞在大鼠体内分布情况及其分离鉴定

目的 了解一种新的牙龈来源的间充质干细胞（gingival tissue-derived mesenchymal stem cells,GMSCs）在大鼠体内的分布情况及其分离鉴定。方法 取成人健康牙龈组织,经dispaseⅡ和胶原酶Ⅳ消化分离单细胞,培养并鉴定为MSCs。将36只SD大鼠（雌雄各半）分成两组：GMSCs移植组（n=24）和对照组（n=12）。GMSCs经尾静脉输入,并分别于移植后1、5、10、20和30天各时间点随机处死4只大鼠,快速取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸骨、肌肉、睾丸或卵巢等组织,冷冻切片后荧光显微镜观察GMSCs生物分布。结果 GMSCs贴壁生长,呈长梭形,具有向脂肪细胞及成骨细胞分化的能力,CD29、CD39、CD73、CD90、CD105阳性率>95%,CD34、CD45、HLA-DR阳性率<5%。荧光显微镜观察结果显示,移植后1天肺CM-Dil阳性细胞数最高,其次为肝、淋巴结、胸腺、脾、肾、骨髓、外周血、卵巢。移植后肺、肝CM-Dil阳性细胞数缓慢下降;移植后10天淋巴结和胸腺CM-Dil阳性细胞数下降明显,但以后保持稳定。GMSCs移植大鼠后1~30天,在心、脑、睾丸、附睾、子宫、肌肉、皮肤等均未见有CM-Dil阳性细胞。结论 GMSCs移植大鼠后,在肺、肝、肾及免疫器官淋巴结、脾、胸腺分布较多,GMSCs移植后具有其特殊的生物分布特征,对将来指导GMSCs用于免疫治疗具有重要意义。