负载IL-4及BMP-2的氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖凝胶对骨免疫和骨修复的早期影响研究

目的探讨负载 IL-4 和 BMP-2 的氧化石墨烯（graphene oxide，GO）-羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）凝胶诱导巨噬细胞 M2 型分化及对 BMSCs 成骨分化的影响。方法取 CMC、GO 制备混合溶液后，分别添加 PBS、IL-4、BMP-2 或 IL-4+BMP-2，在交联剂作用下制备单纯或负载不同因子的 GO-CMC 凝胶支架；取单纯 GO-CMC 凝胶表征观测，包括大体、扫描电镜及傅里叶变换红外吸收光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）检测，以单纯 CMC 凝胶作为对照；取负载不同因子的 GO-CMC 凝胶行体外缓释实验。取 4～5 周龄 SPF 级 SD 雌性大鼠分离培养巨噬细胞，分别与单纯以及负载不同因子的 GO-CMC 凝胶培养，24 h 后行 CD206 免疫荧光检测巨噬细胞分化情况；取第 3 代大鼠 BMSCs 分别与单纯以及负载不同因子的 GO-CMC 凝胶成骨诱导培养，10 d 后行 ALP 染色观测早期成骨，21 d 行茜素红染色观测晚期成骨。结果大体观察 GO-CMC 凝胶呈棕色、半透明状；扫描电镜观察示，GO-CMC 凝胶孔径及孔壁厚度与单纯 CMC 凝胶相似，但内壁粗糙度增加；FTIR 检测显示 CMC 发生聚合形成凝胶。体外缓释实验示 3 种负载不同因子的 GO-CMC 凝胶缓释性能相似，均呈线性缓慢释放因子。CD206 免疫荧光检测示 GO-CMC 凝胶可诱导巨噬细胞 M2 型分化，ALP 及茜素红染色示 GO-CMC 凝胶可诱导 BMSCs 成骨分化；其中负载 IL-4+BMP-2 的 GO-CMC 凝胶作用最显著（P<0.05）。 结论负载 IL-4 和 BMP-2 的 GO-CMC 凝胶可诱导巨噬细胞 M2 型分化，增强 BMSCs 成骨分化能力，为后期骨缺损修复及骨免疫调节研究提供了新的策略。     

力学刺激促进骨髓基质干细胞体外软骨分化

目的探讨离心力刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的作用,以及对三维支架上构建组织工程化软骨的影响,明确力学刺激与细胞分化及组织形成的关系,为体外软骨构建提供适当参数。方法抽取8周龄猪髂嵴骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得第2代BMSCs,以5.0×107/cm3的细胞密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架上,7d后分成4组,在不同的力学条件及诱导条件下培养。8周后取材,行相关检测。结果力学诱导组形成的组织呈白色,细腻光泽,形状规则,体积无明显改变,有良好的弹性和硬度,并具有典型的软骨陷窝结构和大量软骨特异性细胞外基质,Ⅱ型胶原及丰富的聚合蛋白多糖(GAG)成分。GAG含量为(6.0±1.2)mg/g,抗压强度为(2.2±0.8)kPa,弹性模量为(7.4±1.6)kPa。各项指标均明显优于其他各组。结论力学刺激有利于促进BMSCs成软骨分化,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。     

重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用重组人骨形态发生蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其对BMSCs生物学行为的影响,从而为骨组织工程寻找理想的病毒载体及种子细胞。方法全骨髓法培养兔BMSCs,按感染复数(MOI)值不同设定为四组,分别转染兔BMSCs,观察病毒量对细胞形态的影响。选取影响最小的MOI值,进行后续实验。转染兔BMSCs,MTT法描记细胞生长曲线,观察AAV对细胞增殖活性的影响。以重组增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体(AAV-EGFP)为参照,行流式细胞仪检测,计算转染效率。AAV-hBMP4与对照病毒AAV-EGFP分别转染细胞,观察细胞形态,行碱性磷酸酶(ALP)染色、Von Kossa染色及ALP含量测定,观察成骨活性。兔肌袋实验观察异位成骨情况。结果MOI值为5×10~4 vg/cell时,AAV对细胞形态影响最小,以此值进行后续实验。AAV转染后,细胞增殖活性良好,转染效率为55％～65％。AAV-hBMP4转染后,细胞形态呈现典型的成骨改变,ALP染色及Von Kossa染色均出现成骨的特征性改变,而AAV-EGFP组无上述改变。细胞上清ALP含量测定显示,实验组ALP含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(t=218．65,P＜0．01)。兔肌袋实验术后4周组织学检测可见大量钙盐沉积,矿化结节形成。结论AAV-hBMP4转染效率高,对BMSCs的增殖活性影响小,AAV-hBMP4转染的BMSCs可望成为组织工程化骨的理想种子细胞。     

骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研究以多聚乙醇酸(PGA)为支架的骨髓基质干细胞(BMSCs)复合物修复兔膝关节软骨缺损的情况。方法体外培养扩增的自体BMSCs种植于PGA支架并培养72h,然后将支架-细胞复合物植入兔关节软骨缺损模型。术后12周处死动物,标本行大体观察、组织学检查及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果BMSCs-PGA复合物植入后形成丰富的透明软骨样修复组织,新生软骨无明显退变。对照组主要为纤维组织及软骨下骨修复。结论BMSCs-PGA复合物可修复关节软骨缺损。     

生长板软骨细胞促进骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

目的观察骨髓基质干细胞(BMSCs)在生长板软骨细胞旁分泌作用下血管内皮生长因子(VEGF)的表达规律及其与成骨分化的相关性。方法大鼠BMSCs与生长板软骨细胞进行间接共培养,培养终末期做细胞化学染色,定量测定碱性磷酸酶(ALP)活性,用RT-PCR方法半定量检测VEGFmRNA的表达。结果生长板软骨细胞持续高表达VEGF。BMSCs随共培养时间的延长,ALP活性升高,BMSCs的VEGF的表达也逐渐增强。培养液加入两种分泌型VEGF中和抗体后,VEGF表达趋势不变,ALP活性仍为升高趋势,也不影响培养终末期钙化结节的形成。培养终末期BMSCs的CD31和CD34均阴性。结论BMSCs成骨分化过程中VEGF的表达符合成骨细胞分化基因的表达规律,与成骨细胞特征性基因的表达趋势一致,体外条件共培养条件下,中和VEGF后并不能阻碍BMSCs的成骨分化。     

骨髓基质干细胞和神经生长因子悬液移植对脊髓损伤修复的影响

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)移植联用神经生长因子(NGF)对脊髓损伤修复的治疗作用。方法用改良Allen法制成SD大鼠脊髓损伤动物模型(共32只),1周后分别将DMEM、BMSCs、NGF和BMSCs NGF移植入脊髓损伤部位即制成四组(每组8只),移植1、2个月后分别采用神经核蛋白(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和神经丝蛋白(NF)抗体进行免疫荧光染色观察移植的BMSCs的存活及分化情况、损伤部位神经纤维的再生情况。HE染色观察脊髓损伤处空洞面积的改变情况。同时采用BBB运动评分观察大鼠运动功能恢复情况。结果移植1、2个月后,部分移植细胞呈NeuN和GFAP阳性,同时实验组可见明显的神经纤维再生。脊髓损伤处的空洞面积明显减小,差异有显著性意义(P＜0．05),BBB评分结果比对照组均有明显增高,差异有显著性意义(P＜0．05)。在BMSCs NGF组上述改变更加显著。结论BMSCs可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞,BMSCs和NGF能够减小脊髓损伤处的空洞面积,促进受损轴突的再生和运动功能的恢复,两者联合应用在脊髓损伤修复治疗中具有协同作用。     

小肠粘膜下层的制备及细胞相容性的实验研究

目的了解猪小肠粘膜下层(SIS)的细胞相容性,探讨用SIS为生长载体复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构筑组织工程骨的可能性。方法用物理和化学方法处理猪小肠粘膜下层,将兔骨髓基质干细胞与SIS进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。结果经物理和化学处理的SIS纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;BMSCs在SIS材料上生长、粘附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分。结论SIS的细胞相容性良好,不影响BMSCs的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,可以用作骨组织工程的支架材料。     

骨髓间充质干细胞在丝素蛋白/骨形态发生蛋白中的生物学行为观察

目的 观察丝素蛋白与牛骨形态发生蛋白的载体系统与骨髓间充质干细胞的体外相容性.方法 将多孔丝素蛋白修剪成20×10×5 mm长方体状物,置入6孔板中;将粉状bBMP用PBS液溶解制成2mg/ml混悬液,0.5ml无菌移液管滴定于多孔丝素蛋白上(0.5毫升/个).骨髓间充质干细胞以107/ml接种到载体系统上,复合4小时后加入生长液继续体外培养,每1、4、8天时进行碱性磷酸酶、矿化结节染色观察以及扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察;另外同时设立单纯丝素蛋白与细胞复合培养对照组进行观察.结果 倒置显微镜、扫描电镜和共聚焦显微镜下观察到细胞在两种材料上生长形态、活性正常,体外培养24小时时细胞已贴附材料上,呈匍匐状伸展,以后逐渐融合生长,8天时大量细胞成片状攀附在材料表面,并分泌有大量的网状细胞外基质,实验组可见结节状基质生成;碱性磷酸酶、矿化结节染色观察发现实验组细胞碱性磷酸酶和矿化结节染色阳性反应,对照组阴性.结论 丝素蛋白是一种良好细胞外基质材料,也是一种良好生长因子的缓释载体.     

脉冲电磁场影响人骨髓基质干细胞缝隙连接通讯的实验研究

目的研究脉冲电磁场(PEMFs)对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)缝隙连接所介导细胞间通讯(GJIC)的影响。方法透射电镜观察BMSCs超微结构,应用荧光漂白恢复(FRAP)技术,通过激光共聚焦显微镜检测hBM-SCs经PEMFs刺激后GJIC的功能变化。结果经PEMFs刺激后的hBMSCs,平均荧光漂白恢复率为(64.12±0.83)%,较对照组犤(35.26±0.76)%犦有显著性增加(P<0.05)。结论PEMFs刺激能促进hBMSCs的缝隙连接通讯功能。     

异基因骨髓源间充质干细胞对BXSB小鼠T、B细胞的影响

目的：探讨异基因骨髓源间充质干细胞（Bonemarrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）对BXSB小鼠T、B细胞增殖、活化及功能成熟等方面的影响。方法：采用。H．TdR掺入法、FACS法、EIJSA等方法检测BMSCs对BXSB小鼠T、B细胞的影响。结果：BALB／c小鼠的BMSCs在不影响BXSB小鼠T细胞诱导活化的基础上抑制其诱导增殖；可降低由ConA诱导的CD4^＋IL^＋细胞的数量，而提高由ConA诱导的CD4^＋IFN-γ^＋细胞数量。对于B细胞，BALB／c小鼠的BMSCs可以抑制其增殖、活化及IgG的分泌。另外，BALB／c小鼠的BMSCs可以抑制BXSB小鼠B细胞上CIMOL的异位表达。结论：异基因BMSCs对自身免疫病小鼠的T、B细胞有一定的调节作用。