Effect of nuclear factor-κB p65 ASOND on I typ collagen expression and rat hepatic stellate cells proliferation

Objective Sstudy effect of nuclear factor-κB ASOND on I type collagen expression and rat hepatic stellate cells(HSC)proliferation.Methods Rat HSCs were separated by affusing and digestingof Ⅳ type collagenenzyme and density acentric method.Lipid-mediated NF-κB p65 ASOND(0.001,0.01,0.1,1μmol/L)Was transferred into rat HSCs.Toxicity of HSCs caused by NF-κB p65 ASOND and activity of LDH were determined by trypan blue staining.Proliferation affection of transferring NF-κB p65 ASOND into HSCs was determined by MTT.In different concentration NF-κB p65 ASOND.expression of Ⅰ type collagen stimulated by 1mg/L TNF-αwas determined by RT-PCR and ELISA.Results After transfection of NF-κB p65 ASODN,expression of NF-κB protein in HSCs was decreasing.Toxicity experiment indicated that NF-κB p65 ASOND of different concentration(0.001,0.01,0.1 and 1.0 μmol/L)had no effect on HSCs livability and LDH activity(P<0.05).Four different concentration NF-κ B p65 ASOND could restrain HSCs proliferation stimulated by 1 mg/L TNF-α.The expression of I type collagen and mRNA stimulated by 1mg/LTNF-αwas increased,and had a positive correlation with concentration(P>0.05).Conclusion NF-κB p65 ASOND may depress NF-κB activity to restrain HSCs proliferation and Ⅰ type collagen expression,and reduce extracellular matrix.     

EphB4反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的作用

目的观察EphB4反义寡核苷酸(ASODN)对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响,探讨EphB4的生物学功能。方法人工合成EphB4 ASODN,脂质体转染U87细胞。分别应用RT-PCR以及免疫组织化学染色方法检测EphB4 mRNA和蛋白质,评估阻抑效应;并应用MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡;采用Boyden侵袭小室法检测细胞迁移和侵袭力。结果(1)由脂质体转染的EphB4 ASODN对U87细胞EphB4 mRNA和蛋白质表达具有不同程度的抑制作用,且呈现一定的时间-剂量依赖性,600nmol/LASODN作用于U87细胞72h,EphB4 mRNA相对表达量为0.30±0.05,EphB4蛋白表达水平亦明显减弱。(2)各实验组EphB4 ASODN对U87细胞增殖均具有抑制作用,呈明显时间-剂量依赖性;以600nmol/LASODN作用72h,U87细胞生长抑制率达到68.70%,而对照组则无明显抑制作用。(3)EphB4 ASODN诱导U87细胞凋亡呈剂量依赖性。(4)EphB4 ASODN组U87细胞的跨膜数为17.82±2.35,与空白对照组及NSODN组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论EphB4在人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中发挥重要作用,可能成为脑胶质瘤基因治疗的一个新靶点。     

脂质体转染细胞周期素B1反义脱氧寡核苷酸对HL60细胞增殖调控的影响

目的:探讨脂质体转染细胞周期素B1(cyclinB1)反义脱氧寡核苷酸(ASON)对HL60细胞增殖调控的作用。方法:用针对cyclinB1mRNA5’端编码区起始密码子(ATG/AUG)的ASON,通过脂质体导入HL60细胞共培养后,用流式细胞术(FCM)和RT-PCR分别检测cyclinB1蛋白和mRNA的表达水平,电镜和原位细胞凋亡检测法(POD)、FCM及DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡。结果:CyclinB1ASON组与SON及空白对照组相比,ASON能特异地抑制cyclinB1蛋白及mRNA水平的表达,当ASON的浓度达到一定程度时,HL60细胞的增殖及集落形成率均明显受抑制,出现细胞凋亡,并且此作用随ASON浓度的升高而增强。结论:CyclinB1的特异ASON能封闭其蛋白及mRNA的表达水平,可剂量依赖性地抑制白血病细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

血管内皮生长因子基因反义核酸的设计及其对K562细胞增殖的影响

目的:试图用计算机设计并筛选出血管内皮生长因子(VEGF)的高效反义核酸;用实验方法研究VEGF反义核酸对K562细胞增殖的影响。方法:用RNAstructure(version3.7)软件,选择总自由能(overall△G₃₇)相对低的反义核酸,共计7条,长度18-20核苷酸,全硫代修饰;细胞培养72h,采用台盼蓝拒染法观察存活细胞,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白水平,分析反义核酸对K562细胞的作用。结果:筛选出6条反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,均优于阳性对照组(X2)。与随机对照组(X1)相比,最优序列X7组细胞生长抑制率达31.9%、培养液中VEGF蛋白表达抑制率达51.4%,overall△G₃₇与反义药物活性密切相关(r=0.887,P<0.01)。结论:计算机辅助设计有助于获得更好反义药物,VEGF反义药物可抑制K562细胞生长及VEGF蛋白表达,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。     

CpG-ODN诱导白血病HL60细胞分化和凋亡的研究

目的:研究含CpG基序的寡核苷酸对白血病HL60细胞的作用。方法:设计合成含CpG基序的寡核苷酸(CpG-ODN)、不含CpG基序的寡核苷酸(nonCpG-ODN)和含甲基化CpG基序的寡核苷酸(ZpG-ODN)分别作用于白血病HL60细胞,MTT法测定HL60细胞抑制效应,硝基四氮唑蓝还原实验和细胞表面CD14分子表达状况分析HL60细胞诱导分化结果,流式细胞仪和透射电镜观察HL60细胞的凋亡现象,免疫组化检测HL60细胞后caspase3、Bcl-2和Bax的表达状况。结果:CpG-ODN对白血病HL60细胞有诱导分化和诱导凋亡作用,nonCpG-ODN和ZpG-ODN无此作用。结论:CpG-ODN可直接诱导白血病HL60细胞分化和凋亡,此为白血病免疫治疗提供了新的途径。     

结肠腺癌细胞株eIF-4E对NF-κB表达的影响及诱导凋亡机理的探讨

目的研究真核细胞起始因子(Eukaryotic Initiation Factor 4E,eIF-4E)对NF-κB表达及活性水平的影响,并对其阻滞后诱导肿瘤细胞凋亡的途径进行探讨.方法应用脂质体包裹与eIF-4E mRNA翻译起始点互补的反义寡核苷酸(asODN),处理人大肠腺癌细胞LS-174T.使用Western blot和RT-PCR方法分别检测eIF-4E被阻抑后其转录和翻译水平的改变.EMSA用来比较eIF-4E阻滞前后NF-κB活性的改变.采用流式细胞仪检测LS-174T细胞凋亡.结果eIF-4E被阻抑表达后,NF-κB蛋白表达和活性水平也有显著下降.伴随eIF-4E表达和NF-κB活性水平下降,LS-174T细胞的凋亡率显著升高.结论本试验证明NF-κB受eIF-4E的翻译调控,eIF-4E的抗凋亡作用部分可能是通过调节NF-κB活性来实现的.此结论对于结肠癌试验性和肿瘤临床的基因治疗具有一定意义.     

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制人喉癌细胞系增殖的研究

目的探讨ｂｃｌ－２反义寡聚脱氧核苷酸在喉癌基因治疗中的可能作用及机理。方法采用人工合成与ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ起始码及其后４个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，处理培养的人喉癌细胞系Ｈｅｐ－２细胞，观察其对细胞增殖的影响。同时采用原位分子杂交及免疫组化技术，检测细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ及Ｂｃｌ－２蛋白水平，分析其变化规律。结果ｂｃｌ－２反义核酸片段对细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ无明显影响，但可以显著抑制Ｂｃｌ－２蛋白合成，抑制率与反义核酸浓度及作用时间呈正相关。２０．０μｍｏｌ／Ｌｂｃｌ－２反义核酸可以有效地抑制细胞增殖。结论提示ｂｃｌ－２反义核酸可以在翻译水平特异性地抑制Ｈｅｐ－２细胞中Ｂｃｌ－２蛋白的合成与细胞增殖。进一步证明ｂｃｌ－２基因在喉癌的发生发展中具有十分重要的作用。     

反义局部粘着斑激酶脱氧寡核苷酸对肝癌细胞侵袭性生长的抑制作用

目的 观察反义局部粘着斑激酶脱氧寡核苷酸(FAK ODN)转染对肝癌细胞侵袭性生长的影响,并探讨其作用机制。 方法 以LipofecTAMINE介导的反义FAK ODN转染Bel 7402肝癌细胞株,测定Bel 7402肝癌细胞株体外生长曲线、细胞活力,测定不同时间点该细胞体外黏附能力变化,以Transwell小室测定细胞的体外侵袭能力,同时行FAK表达与细胞DNA含量的双参数流式细胞仪检测及细胞凋亡的流式细胞仪检测。 结果 p125FAK表达在反义转染组(6.49％±0.10％)显著低于正义转染组(14.33％±1.88％)与对照组(16.68％±1.62％),F=7.66,P<0.01;反义FAK ODN转染显著抑制Bel 7402肝癌细胞株的生长,其细胞活力显著下降,肿瘤细胞抑制率在30％-60％之间;细胞体外黏附能力受到显著抑制,黏附抑制率在25％-55％间;细胞的体外侵袭能力显著下降,侵袭抑制率在15％-25％之间;细胞凋亡显著增加;细胞周期分析显示S期细胞比率显著降低,细胞生长主要阻滞在G2/M期。 结论 FAK在Bel 7402肝癌细胞的黏附与迁移运动中发挥重要作用,其表达阻断显著抑制肝癌细胞的体外黏附与侵袭活性。FAK表达阻断显著抑制肝癌细胞的体外增殖,促进细胞凋亡。     

New routes in frontotemporal dementia drug discovery

Introduction: Research into the pathogenic mechanisms behind frontotemporal dementia (FTD) has yielded several new targets for therapeutic intervention; such targets include specific new pathways uncovered by mutations as well as targets involving the modulation, formation and degradation of protein aggregates.

Areas covered: Herein, the authors outline the principal molecular causes underlying FTD to date and the research that has been performed in these areas with respect to an eventual corrective strategy.

Expert opinion: While it is worthwhile targeting pathways affected by specific mutations with a causative loss of function linked to FTD, research still has to contend with issues including the remaining presence of protein aggregates or that treatments are rarely universally applicable. Aiming to recover function in a downstream target caused by the protein aggregates will likely be insufficient due to the large cascade of events affected. It is our belief that the clearance of these aggregates and the inhibition of protein misfolding are more appropriate and direct routes to an eventual therapy.     

端粒酶逆转录酶在五羟色胺诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖过程中的作用

目的研究端粒酶逆转录酶（TERT）在五羟色胺（5-HT）诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖过程中的作用。方法组织块法培养大鼠PASMCs。大鼠PASMCs增殖实验分别检测5-HT和反义TERT寡核苷酸对大鼠PASMCs增殖的影响。激光共聚焦显微镜检测异硫氰酸荧光素（FITC）标记的反义TERT寡核苷酸,明确反义TERT寡核苷酸在PASMCs中的分布。原位杂交实验和免疫组化实验检测反义TERT寡核苷酸和5-HT对PASMCs中TERT的mRNA和蛋白表达的影响。结果5-HT诱导大鼠PASMCs增殖实验证实5-HT在10^-9-10^-5mol／L的剂量范围内,5-HT对大鼠PASMCs的促增殖作用具有剂量依赖性。原位杂交实验和免疫组化实验证实5-HT可能直接或间接促进TERT的mRNA和蛋白表达。FITC标记的反义TERT寡核苷酸在激光共聚焦显微镜下显示,反义TERT寡核苷酸主要分布于PASMCs胞质。反义TERT寡核苷酸对大鼠PASMCs增殖抑制实验证实反义TERT寡核苷酸可以抑制5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖,而正义TERT寡核苷酸对5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖没有作用。原位杂交实验和免疫组化实验证实反义TERT寡核苷酸可以抑制5-HT引起的TERT的mRNA和蛋白表达增强。结论研究结果提示,TERT在5-HT诱导的PASMCs增殖过程中发挥重要作用,通过反义技术抑制TERT表达为肺动脉高压的基因治疗提供了理论基础。