肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其在生物膜形成中的作用

目的：构建肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因（crp基因）缺失突变株与回补株，了解crp基因在肺炎克雷伯菌生物膜形成中的作用。方法设计位于crp基因（566 bp）上游698 bp片段及下游576 bp片段的两对引物，分别扩增出相应片段并通过融合PCR构建一个1274 bp片段的突变盒，利用双酶切克隆的方法将突变盒克隆至温度敏感性自杀载体pKO3-Km的NotⅠ位点间，电转化至肺炎克雷伯菌中构建肺炎克雷伯菌crp基因无痕缺失突变株（Δcrp）。扩增包含crp基因编码、启动子结合区及转录终止区的2063 bp基因片段并克隆至pGEM-T-easy质粒上，将此质粒电转至crp基因缺失突变株中构建crp基因回补株（C-crp）。采用RT-PCR方法检测crp基因在基因缺失株与回补株的表达情况，确定crp基因缺失突变株与回补株构建成功。利用结晶紫染色法检测crp基因对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响，并通过酵母凝集试验检测crp基因对肺炎克雷伯菌的菌毛形成影响。结果成功构建了肺炎克雷伯菌crp基因缺失突变株与回补株，RT-PCR结果显示，crp基因在缺失突变株中无表达，在回补株重新表达。体外试管静止培养48 h后，crp基因缺失株无明显生物膜形成，而在野生株及回补株的液体培养基表面形成宽厚生物膜。结晶紫染色定量发现，crp缺失突变株的生物膜相对形成量显著低于野生株（0.063±0.011 vs 1.020±0.056，P＜0.001）。酵母凝集试验发现在crp基因缺失突变株中细菌菌毛生成能力下降，提示crp基因影响肺炎克雷伯菌菌毛的生成。结论肺炎克雷伯菌crp基因可能通过调控肺炎克雷伯菌菌毛生成而正调控细菌生物膜的形成。     

基于PubMed数据库医学真菌生物膜研究文献计量学分析

目的分析全球医学真菌生物膜文献概貌,了解医学真菌生物膜研究现状,为进一步研究提供思路和依据。方法利用汤森路透的TDA软件分析Pub Med数据库收录的医学真菌生物膜相关文献的时间、国家、期刊、作者和高频主题词分布,分析引用前20位文献类型及内容,并制作作者合作网络图。结果医学真菌生物膜相关文献自1999年至今文献数量处于稳步增加的趋势,美国和欧洲在该研究领域处于主导地位,文献也主要发表于美国和欧洲的该领域核心期刊。发文量前10的作者中有3位来自于美国凯斯西储大学皮肤病学系医学真菌中心。医学真菌生物膜研究对象主要集中于念珠菌属和酿酒酵母,研究方向主要集中于医学真菌生物膜的形成、其与抗真菌药物的相互作用以及医学真菌发挥该毒力相关的基因和蛋白基础。被引频次排位与文献贡献排位作者趋势具有一定的一致性。中国该领域研究主要集中于香港和北京地区。结论欧美仍是该领域的研究大国,近5年中国内地的文献数量和引用率开始增加。临床常见医学真菌和模式真菌生物膜的形成、药敏及其毒力相关机制是医学真菌生物膜的主要研究热点。