livin在肺癌组织中的表达及与caspase-3的相关性初步探讨

背景与目的 livin是新的凋亡抑制蛋白家族成员之一,本研究目的在于探索livin两种异构体在肺癌组织中的表达及其与肺癌病理类型、化疗的关系和livin表达与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达的相关性.方法 采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法检测肺癌组织及对照组中livin α、livin β及caspase-3的表达.结果 27例肺癌组织中livin α表达阳性率为44.44%,livin β为70.30%,显著高于对照组(P值均＜0.01),其中在腺癌组织中分别为50.00%和64.28%,在鳞癌(含大细胞癌)组织中分别为33.33%和75.00%,1例小细胞癌两异构体均阳性.应用凝胶成像仪测量各指标灰度值后显示,肺癌组织两异构体表达水平明显高于对照组(P值均＜0.05);livin α在腺癌中表达明显高于鳞癌(P＜0.05),而livin β在腺癌、鳞癌中表达无明显差异(P＞0.05);caspase-3在肺癌组织中的表达明显低于对照组(P＜0.01),livin各异构体表达水平、两异构体水平总和皆与caspase-3表达水平呈负相关(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01).livin两异构体在术前化疗的肺癌组织中表达似乎较未化疗者高,但差异无统计学意义(P＞0.05),而且其表达与肺癌是否发生淋巴结转移亦无明显相关性(P＞0.05).结论 livin两异构体在不同病理类型肺癌组织中表达不一致,可能与不同病理类型肺癌发生有关;livin表达与caspase-3表达呈负相关,可能与livin具抗凋亡作用有关;livin高表达似乎与化疗诱导有关,而与肺癌是否转移无明显相关.     

凋亡抑制基因livin在食管癌中的表达

目的:探讨凋亡抑制蛋白livin在食管癌组织中的表达及其与食管癌临床病理的相关性。方法:采用RT-PCR结合银染技术检测食管癌组织中livin-α mRNA和livin-β mRNA的表达。结果:36例食管癌组织中livin表达阳性率为50%,其表达与癌组织浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05),而与癌组织分化程度无关(P>0.05)。18例癌旁正常食管组织中livin低表达,阳性率为5.6%,与食管癌组织比较差异十分显著(P<0.01)。结论:livin在食管癌组织中异常表达,有望成为食管癌诊断和基因治疗的新靶点。     

针对livin的siRNA表达载体的构建

目的设计能够有效抑制livin基因表达的小干扰RNA,构建针对livin基因的siRNA重组表达载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的一组寡核苷酸片段,克隆到pSilencerTM3．1-H1hygro载体,并经BamHI／EeoRI双酶切及测序鉴定证实,livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体中。结果经BarnHI／EcoRI双酶切及测序鉴定证实,人livin的siRNA序列成功地克隆到表达载体pSilencerTM3．1．H1hygro中,构建了表达载体,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建了livin表达载体,为后续研究奠定基础。     

Genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响

目的观察genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响。方法应用RT-PCR检测不同浓度genistein作用LiBr细胞48 h后Livin的表达变化;取最适浓度的genistein作用LiBr细胞后应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用Western blot检测其对凋亡效应蛋白Ccaspase-3表达的影响及应用MTT比色法检测其对细胞增殖的作用。结果 Genistein可增加LiBr细胞早、晚期凋亡率[分别为(27.87±5.38)%和(11.87±3.86)%],诱导LiBr细胞凋亡(P<0.01);引起细胞G0/G1期阻滞[G0/G1=(72.11±5.89)%、S=(14.53±3.47)%、G2/M=(12.36±2.64)%];下调caspase-3蛋白表达及抑制细胞增殖(P<0.01)。结论 Genistein可诱导LiBr细胞凋亡、使细胞增殖周期进展受阻、抑制细胞增殖。     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的：运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法：用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果：重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达（P〈0.01）。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论：成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

Livin、cleavedcaspase的表达-3在尖锐湿疣中

目的：确定livin和cleavedcaspase-3在尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）组织中的表达及意义。方法：采用免疫组化sP法检测livin和cleavedcaspase-3在34例CA组织和15例正常皮肤组织中的表达。结果：正常皮肤中livin与cleavedcaspase-3均无表达，CA组织中二者表达的阳性率分别为82．4％和38．2％；两种蛋白在CA组织中的表达呈负相关（r=-5．25，P〈0．001）。结论：Livin抑制caspase-3的激活，两者共同参与CA的发病过程，可能与CA的发生、发展相关。     

携带人livin α基因腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:本研究旨在利用AdMax系统构建携带人抗凋亡基因livinα的重组腺病毒载体(rAd-livinα),并感染树突状细胞(Dendritic cells,DCs),制成DCs疫苗,为下一步用此疫苗抗肿瘤实验奠定基础。方法:以质粒pIRES2-EGFP-livinα为模板,通过PCR扩增出人livinα基因cDNA序列,再将livinα基因cDNA亚克隆于穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv,获得重组质粒pDC316-EGFP-cmv-livinα。将鉴定后的重组穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-livinα与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组获得重组腺病毒rAd-livinα。用重组腺病毒rAd-livinα感染人DCs后,Western blot方法分析livinα蛋白表达,流式细胞仪检测DCs的表型变化。结果:在HEK293细胞内能观察到重组腺病毒rAd-livinα绿色荧光蛋白的表达。rAd-livinα经PCR鉴定特异性地扩增出符合预期大小的片段。rAd-livinα感染的DCs中可检测到livinα蛋白的表达,并且感染的DCs与未感染DCs比较,可明显提高了细胞表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达(P<0.05)。结论:通过AdMax系统成功构建了重组腺病毒rAd-livinα,使livinα蛋白有效表达于DCs中,并且重组腺病毒感染的DCs的成熟度得到提高。     

mPEG-CS纳米粒介导livin与survivin小干扰RNA杀伤结肠癌细胞

目的 以mPEG-CS纳米粒作为livin基因和survivin基因的干扰RNA的载体,转染人结肠癌细胞HT-29,观察livin和survivin沉默对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 利用离子交联法,制备粒径约60nm的mPEG-CS纳米粒.利用静电吸附法,以纳米粒混悬液与基因溶液配比为3∶1的条件,构建mPEG-CS-livin shRNA纳米粒、mPEG-CS-survivin shRNA纳米粒以及mPEG-CS-(livin shRNA+surviving shRNA)纳米粒,之后,分别转染进人结肠癌HT-29细胞中.利用RT-PCR和Western Blot分别检测livin、survivin基因和蛋白的表达变化;利用MTT法检测livin、survivin基因表达下调对HT-29细胞增殖的抑制效率;利用Hoechst染色检测livin、survivin基因沉默对HT-29细胞凋亡的诱导.结果 各干扰组均能在mRNA和蛋白水平上有效抑制HT-29细胞中livin、survivin的表达.MTT和Hoechst染色结果显示,联合干扰livin和survivin基因可有效抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖,并促进细胞凋亡,且效果均强于单独干扰livin或survivin基因.结论 mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰能有效降低人结肠癌HT-29细胞中livin和survivin基因的表达,抑制HT-29细胞的增殖,并促进HT-29细胞的凋亡,其效果强于单独干扰livin或survivin基因.双基因联合干扰具有协同增强效应.     

Comparison between cells and cancer stem-like cells isolated from glioblastoma and astrocytoma on expression of anti-apoptotic and multidrug resistance-associated protein genes

This study is to explore and compare the features of the cells and cancer stem-like cells (CSCs) isolated from both glioblastoma and astrocytoma on expression of anti-apoptotic and multidrug resistance-associated protein (MRP) genes. As a result, the mRNA expression of livin, livinalpha and MRP1 was up-regulated in human CSCs from 2 times to 85 times, but the gene expression of MRP3 was down-regulated from 0.09 times to 0.5 times. After just differentiation the mRNA expression of livin, livinalpha and MRP3 was up-regulated from 9 times to 64 times, but the mRNA expression of MRP1 was down-regulated from 0.01 times to 0.03 times. It is a rare report that glioma stem-like cells can be induced successfully from a grade 2-3 astrocytoma tissue. The properties of glioblastoma and astrocytoma stem-like cells on anti-apoptotic and MRP genes are: anti-apoptotic gene livin and survivin are elevated in CSCs but are the most increased in just differentiated CSCs; MRP1 gene is significantly increased and MRP3 is decreased in CSCs, but when differentiating the MRP3 gene starts a remarkable increase in CSCs; the expression of anti-apoptotic and MRP genes shows no differences between the CSCs isolated from glioblastoma and astrocytoma tissues.     

Livin和Survivin基因在成人急性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义

本研究旨在探讨凋亡抑制蛋白家族成员livin和survivin基因在成人急性淋巴细胞白血病(ALL)中的基因表达及其临床意义。应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测95例成人ALL患者(包括52例初治ALL患者,23例治疗后复发的ALL患者以及20例完全缓解的ALL患者)骨髓中和20例健康者外周血中的livin和survivinmRNA表达情况。结果表明,成人ALL患者初治组、复发组中livin和survivin的表达均明显高于缓解组和正常对照组;初治成人ALL患者中,livin和survivin的表达与否与患者的年龄、性别、分型、初诊时白细胞水平均无明显相关;初治成人ALL患者中,livin、survivin表达阳性的患者缓解率明显低于表达阴性的患者;livin和survivin在成人ALL初治组中的表达无明显相关性。结论:livin和survivin可能参与成人ALL的发生与发展;livin和survivin高表达可能是成人ALL预后不良指标;livin和survivin在成人ALL中可能没有协同表达作用。