慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立

目的针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系，以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒（携带EGFP基因）包装（脂质体介导的瞬时转染）、超速离心浓缩和保存等，随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞，24—48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产；将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FF细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内，感染6—12h后，用相应培养基替换感染液，数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞。结果按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒（病毒上清或浓缩后的病毒）成功高效率感染293FF细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞；用浓缩后的病毒（携带EGFP基因）感染小鼠ES细胞，亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆。结论熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术，同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统，这些为相关后续研究打下了良好的基础。     

Human Retrovirus Genomic RNA Packaging

Two non-covalently linked copies of the retrovirus genome are specifically recruited to the site of virus particle assembly and packaged into released particles. Retroviral RNA packaging requires RNA export of the unspliced genomic RNA from the nucleus, translocation of the genome to virus assembly sites, and specific interaction with Gag, the main viral structural protein. While some aspects of the RNA packaging process are understood, many others remain poorly understood. In this review, we provide an update on recent advancements in understanding the mechanism of RNA packaging for retroviruses that cause disease in humans, i.e., HIV-1, HIV-2, and HTLV-1, as well as advances in the understanding of the details of genomic RNA nuclear export, genome translocation to virus assembly sites, and genomic RNA dimerization.     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5 α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-APRIL shRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107 TU/ml.感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P＜0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P＜0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异.结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRILshRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达.     

慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。     

慢病毒携带shRNA抑制CR-1基因表达对 CNE-2细胞特性的影响

 【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,有效沉默鼻咽癌细胞CNE-2的CR-1基因表达,研究CR-1对鼻咽癌细胞生物学行为的影响&;#65377; 【方法】 构建针对CR-1的siRNA慢病毒表达载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]&;#65377;利用包装细胞293FT生产慢病毒,感染鼻咽癌细胞CNE-2, 流式筛选GFP阳性细胞&;#65377;应用荧光定量PCR&;#65380;Western blot检测病毒感染后CNE-2细胞中CR-1基因的mRNA和蛋白表达,获得干扰CR-1基因的细胞群&;#65377;并用MTT法&;#65380;平板克隆形成实验及Boyden侵袭小室观察CR-1干扰后对CNE-2细胞生物学行为的影响&;#65377; 【结果】 PCR 和测序证实,成功构建了CR-1 shRNA的慢病毒载体pLVTHM-shCR-1&;#65377;荧光定量PCR 和Western blot结果表明,所获得的细胞中CR-1 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组&;#65380;空白对照组均显著降低(P < 0.05)&;#65377;CR-1干扰后的细胞生长明显减慢,克隆形成能力减弱,侵袭运动能力下降&;#65377; 【结论】 通过RNAi技术阻断CR-1的表达,可抑制CNE-2细胞的生长&;#65380;增殖&;#65380;迁徙,提示CR-1在鼻咽癌的发生&;#65380;发展过程中起重要作用&;#65377;     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

小鼠microRNA-21慢病毒抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-21(miR-21)慢病毒抑制载体,为研究miR-21在小鼠体内的功能及作用机制打下基础。方法利用miR-21前体并将其克隆入LV3pGLV-H1-GFP质粒中,经酶切及测序鉴定,利用脂质体将鉴定的阳性重组LV3pGLV-H1-GFP-miR-21抑制载体、PG-P1-VSVG和pCMV-dR3个质粒转染到HEK-293T细胞,将所得病毒感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒感染乳鼠心肌细胞和尾静脉注射小鼠,检测miR-21在小鼠体内的表达。结果酶切及测序结果证明成功构建了LV3pGLV-H1-GFP-miR-21重组质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为2.4×109TU/ml,重组病毒成功感染心肌细胞,同时在Balb/c小鼠心脏有表达。结论成功构建miR-21慢病毒抑制载体,获得高效表达miR-21的慢病毒颗粒,为miR-21的进一步研究奠定了基础。     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

S100PshRNA慢病毒载体的构建及其对胃癌MGC-803细胞生物学行为的影响

目的：：构建针对S100P基因的shRNA慢病毒载体,并在胃癌MGC-803细胞上鉴定沉默效率,观察其对细胞生物学行为的影响。方法：筛选的S100P基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA,并与GV115-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,与pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒。用病毒感染MGC-803细胞,RT-PCR和Western blot检测靶基因的沉默效率、克隆形成情况、细胞周期变化和凋亡实验观察靶基因沉默对MGC-803的影响。结果：构建的重组shRNA慢病毒载体,经293T细胞包装获得病毒颗粒,和阴性对照相比,慢病毒感染组S100 P mRNA表达下降了83.4%,蛋白表达也明显受到抑制。 S100 P沉默后MGC-803的克隆形成能力明显减弱,细胞周期发生S期阻滞,细胞凋亡明显增加。结论：成功地构建了S100P基因shRNA慢病毒表达载体,该载体能够在MGC-803细胞中沉默S100P基因的表达,导致胃癌细胞克隆形成能力降低,细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,表明S100 P基因有可能具有影响胃癌发生发展的作用。