丙型肝炎病毒NS5A在肝癌细胞对TLR4表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A（HCV NS5A）对Toll样受体4（TLR4）表达的影响。方法用含HCV NS5A基因的表达质粒pcNS5A瞬时转染QSG7701细胞,采用免疫细胞化学技术检测HCV NS5A及TLR4蛋白质的表达;采用逆转录聚合酶链反应观察HCV NS5A和TLR4的mRNA表达。结果转染pcNS5A质粒细胞内有HCV NS5A蛋白的表达。转染pcNS5A组TLR4 mRNA及蛋白质表达均较转染pRc/CMV和未转染质粒组明显增强,而后两组细胞TLR4 mRNA和蛋白质表达相似。结论 HCV NS5A可上调TLR4 mRNA和蛋白的表达。     

HCV 3b亚型全长序列测定及基线耐药相关置换的分析

目的探讨二代测序法(NGS)在HCV 3b全长序列及基线耐药相关置换(RAS)检测中的应用。方法从1例2016年7月在广州血液中心献血的献血者(HCV RNA阳性)血浆中提取核酸,经序列非依赖性扩增后,构建测序文库并采用illumina Hiseq进行深度测序,然后通过生物信息学方法分析HCV全长序列、病毒基因分型以及针对直接抗病毒药物(DAA)的基线RAS。结果NGS获得8.4 Gb原始测序数据,序列数(reads)超过56 M。经生物信息学分析获得HCV全长序列,平均测序深度为488007,基因分型结果为3b亚型。病毒氨基酸序列里含有12个RAS,分别是NS3区域的Y56H、Q80K、Q80R、A156G,NS5A区域的M28G、Q/A30G、Q/A30K、L31F、L31M、Y93H,以及NS5B区域的S282T和V321A,其中位于NS5A区域的Q/A30K和L31M属于高丰度RAS(99.16%和98.37%),其余10个RAS丰度较低(<0.5%)。结论NGS用于HCV 3b亚型的全长序列检测和基因分型,最终鉴定出基线RAS,对于HCV 3b的流行病学研究和DAA治疗方案的制订有重要意义。     

BILN2061、telaprevir和boceprevir治疗慢性丙型肝炎临床疗效比较

HCV感染易导致慢性肝炎、肝硬化及肝癌等相关性疾病,病死率较高.HCV在体内的翻译是经宿主信号肽和非结构蛋白(non-structural protein,NS)3病毒蛋白酶水解成熟.此外,NS3还可直接破坏宿主细胞,抑制其对干扰素的应答,因此研究HCV NS3具有重要的临床意义.本文通过对3种NS3/4A蛋白酶抑制剂(BILN 2061、telaprevir和boceprevir)的药理作用、药动学与代谢、安全性和临床研究进行分析,总结其作用特性和临床疗效.同时,对boceprevir和telaprevir(VX-950)分别联合聚乙二醇干扰素和利巴韦林的疗效进行评价,为临床医生治疗慢性丙型肝炎提供指导.     

肝特异性miR-122调控肝脏疾病的研究进展

miRNA-122(miR-122)是肝特异性微小RNA,在肝脏的生理功能和疾病方面都有重要的作用。阐述了miR-122与脂肪性肝炎的相关性及可能机制,探讨了miR-122表达水平的改变参与调控HCV和HBV感染的作用及机制,并归纳了miR-122在肝细胞癌(HCC)的发生发展中的作用。认为miR-122在肝脏中的诸多功能可为未来研发治疗肝脏疾病的药物提供新的靶点及新的治疗策略。     

调控型表达丙型肝炎病毒NS3／4A蛋白酶转基因小鼠的建立

目的建立调控因素存在下表达丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A丝氨酸蛋白酶的转基因小鼠。方法采用分子克隆技术构建可受Tet-On调控系统和Cre-LoxP基因敲除系统双重调控表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的真核表达质粒PBI-Ⅲ/LoxP-Luc-PolyA-LoxP-NS3/4A。该重组质粒线性化后,经显微注射制备转基因小鼠。首建鼠及经PCR检测阳性的子代鼠与C57BL/6小鼠交配传代。选择部分F2鼠与已经稳定建系的转基因小鼠Lap杂交,利用在体生物发光成像系统（BLI）检测肝脏稳定表达荧光素酶（Luc）报告基因的经盐酸强力霉素（Dox）诱导的双转基因子代鼠,并选择性针对稳定表达系传代扩群。结果酶切鉴定和测序分析显示重组载体构建成功。经PCR检测得到6只转基因首建鼠,其中3只可繁殖传代并持续检测到阳性子代鼠。BLI结果显示,由其中1只首建鼠传代而来的不同F2鼠与Lap鼠杂交得到的部分双转基因鼠肝脏部位发光信号强烈,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达。结论建立了转基因小鼠NS3/4A,并筛选到调控因素存在时转入外源基因特异稳定表达的转基因小鼠,为进一步建立严格调控型表达NS3/4A蛋白酶的小鼠模型奠定基础。     

Tet-on和Cre／loxP双调控肝靶向表达Cre重组酶转基因小鼠的制备和功能评价

目的制备Tet-on和Cre/loxP系统双重调控下肝靶向性表达Cre重组酶的转基因小鼠rtTALAP-1/LC-1并评价其功能,为最终建立可突破胚胎期免疫耐受的双调控型HCV转基因小鼠模型奠定基础。方法选取适龄rtTALAP-1转基因小鼠与LC-1转基因小鼠交配,PCR法检测子代rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠基因组中是否插入了rtTA元件和Cre基因片段。双阳性rtTALAP-1/LC-1小鼠dox诱导1周后,以小动物活体成像系统检测小鼠肝脏的Luc萤光素酶信号,免疫组化检测Cre重组酶在小鼠肝脏等组织中的表达状况。结果 rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠在dox诱导后,仅在其肝脏检测到清晰的Luc萤光素酶信号,而其他脏器均未检测到萤光信号;免疫组化法也仅在小鼠肝细胞核中检测到Cre重组酶的表达,心脏、肾脏和骨骼肌等其他组织均未检测到Cre重组酶的表达。结论成功制备了rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠,其靶基因表达的诱导反应性和肝靶向性均良好,为最终制备双调控型丙型肝炎病毒（HCV）转基因小鼠模型奠定了良好的基础。     

丙型肝炎基因型分布特点及流行分析

目的分析萍乡地区丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒(HCV)基因型,了解本地区丙型肝炎分布及流行情况,为慢性丙型肝炎的诊断、治疗及预防提供有力的依据。方法利用门诊及住院患者血清HCV抗体阳性标本,经荧光定量PCR检测HCVRNA阳性标本102例,用基因芯片进行基因分型检测。结果检测HCV感染标本102例,共检出7种基因亚型,分别为1b、6型、2a、1b+2a、1b+3a、3a和3b,其中1b占72.6,6型占8.8,2a占7.8,1b+2a占5.9,1b+3a占2.9,3a占1.0,3b占1.0。结论萍乡地区HCV基因型主要为1b,6型为第2常见亚型,混合基因型感染较多;有吸毒史、外伤史、输血史三者合计76例,占74.5。安源区和湘东区所占比例较大。     

核酸扩增及微流芯片技术在献血者HCV筛查中的应用

目的 应用核酸扩增和微流芯片分析方法,用于献血者血液标本丙型肝炎病毒(HCV)的检测.方法 选取80份疑似HCV感染的血液标本,分别采用2种ELISA法、胶体金法、化学发光免疫分析(CLIA)法和核酸扩增后微流芯片法分析.结果 经过核酸扩增的HCV阳性血液经分析后皆出现预期大小片段的特异性条带,而阴性血液缺少相应的条带...     

重庆地区HCV基因亚型的分布状态

目的:探讨重庆地区丙型肝炎病毒(HCV)流行的基因亚型分布状态.方法:在77份抗HCV抗体和HCV RNA均阳性的血清标本中,分别提取HCV RNA,通过逆转录巢式PCR(RT nested-PCR)扩增C基因的羧基端至E1基因的氨基端长度为474 bp的片段,测定其核苷酸序列,与GenBank中已知的HCV序列进行系谱分析,确定HCV基因亚型.结果:77份HCV感染者血清标本通过RT-nested PCR检测均获得阳性条带,该方法特异性和敏感性均较好.序列与系谱分析显示1b 29例(38%),2a 10例(13%),3a 12例(16%),3b 11例(14%),6a 15例(19%),未见1a和2b型.结论:重庆地区HCV流行的基因亚型有1b,2a,3a,3b,6a共5种,1b为流行的主要基因亚型.2a,3a,3b和6 a型均占相当比例,初步说明重庆地区HCV流行的基因亚型呈现多样性.     

直接抗病毒药物治疗丙型肝炎肝硬化早期抗病毒疗效及安全性临床实践研究

目的评价直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agents,DAAs)治疗丙型肝炎肝硬化的早期抗病毒疗效及安全性。方法给予基因1b型丙型肝炎肝硬化患者DAAs抗病毒治疗。方案1:sofosbuvir+ribavirin(RBV);方案2:sofosbuvir+ledipasvir+RBV;方案3:sofosbuvir+daclatasvir+RBV,疗程均为24周。观察不同治疗时间点的病毒学和生物化学指标变化以及患者的不良反应。本研究先期分析24例患者12周的数据。结果完成12周治疗的24例患者中,方案1组12例,方案2组和方案3组均为6例。24例应用DAAs治疗1、2、4和12周HCV转阴率分别是25.00%(6/24)、45.83%(11/24)、66.67%(16/24)和70.83%(17/24),随着治疗时间的延长,HCV转阴率逐渐上升。方案1组中,初治和经治患者治疗12周时HCV转阴例数分别为4例和1例;方案2和3组中,初治和经治患者治疗12周时HCV转阴例数均为3例。截至2016年1月,有3例随访至停药12周,1例在方案1组,该患者停药12周后复发,HCV RNA为1.8×106 IU/ml;2例在方案2组,达到治疗12周持续病毒学应答,HCV RNA未检测到。DAAs治疗2周后ALT降到正常值范围,12周时仍在正常值范围。治疗1周时CK和CK-MB稍有上升,但差异无统计学意义,2周后降到正常值范围,12周时仍在正常值范围。在DAAs治疗过程中,BUN和CRE无显著性升高,无须调整DAA剂量。DAAs常见的不良反应是恶心(58.83%)。结论基因1b型丙型肝炎肝硬化患者应用DAAs抗病毒治疗早期疗效好,安全性高。对于经治患者应用sofosbuvir联合ledipasvir或daclatasvir。