亚硝基铁氰化钠处理的弓形虫速殖子的超微结构特征

目的 观察一氧化氮（NO）供体亚硝基铁氰化钠（SNP）处理的弓形虫速殖子的超微结构特征。方法 应用透射电镜观察SNP处理的速殖子的超微结构。结果 发现SNP处理的速殖子大部分具有凋亡的典型形态学特征：核染色质凝集,核固缩,核碎裂,凋亡小体形成（个别速殖子形态表现为胀亡细胞、溶解性坏死细胞和坏死型凋亡细胞特征）。结论 从形态学上证明NO供体SNP可诱导弓形虫速殖子凋亡及坏死。     

刚地弓形虫速殖子与鼠星形胶质细胞体外共培养的实验观察

原代培养星形胶质细胞,待其长至培养皿的80%时,将星形胶质细胞与弓形虫速殖子(细胞与虫体的比例为1∶10)共培养0～72h,吉氏染色观察星形胶质细胞和弓形虫速殖子的变化。共培养1h,此时定为0点,再培养0～48h,单磺酰戊二胺染色在荧光显微镜下观察星形胶质细胞内自噬囊泡的变化。结果发现共培养1h时,弓形虫速殖子开始进入星形胶质细胞,并出现荧光颗粒;8h星形胶质细胞内荧光颗粒最多;12h后显著减少,星形胶质细胞开始被破坏;48h星形胶质细胞内荧光颗粒消失;72h大部分星形胶质细胞已被涨破,留下大量增殖的弓形虫速殖子。说明自噬在弓形虫速殖子体外感染星形胶质细胞的过程中是受到抑制的。     

丝裂原激活蛋白激酶抑制剂对弓形虫速殖子侵入宿主细胞信号转导途径的阻断效应

目的观察丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)抑制剂对弓形虫速殖子侵入细胞的影响。方法 IFA 荧光标记检测在不同剂量抑制剂作用下及在不同时间其宿主细胞感染速殖子的差异;SDS-PAGE 和 Western blot 分析 MAPK 的表达及其相对活性。结果在 PD980591μM 和10μM 作用下其感染率仅分别为对照组的18.00%(u=9.03,P<0.01)和14.80%(u=7.93,P<0.001);在 PD98059 50μM 作用下宿主细胞感染率在24h 和48h 分别为对照组的55.45%(u=3.58,P<0.01)和49.15%(u=4.08,P<0.01);与对照比较,其 MAPK 的相对活性明显下降,10μM 和50μM 组分别降低了43.03%(u=2.72,P<0.01)和78.79%(u=5.74,P<0.001)。结论 PD98059通过作用于 MAPK 信号转导途径而抑制速殖子侵入宿主细胞的过程。     

RNA原位杂交法动态观察弓形虫速殖子对BALB/c小鼠小肠黏膜的黏附及侵入

目的 RNA原位杂交法观察弓形虫速殖子黏附和侵入小肠黏膜的部位及时间。 方法 30只BALB/c小鼠随机分为两组,实验组（24只）每鼠灌胃感染2×104个弓形虫速殖子（悬于0.2 ml PBS）,对照组（6只）给予等量PBS。分别于感染后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h和8 h各处死实验组小鼠4只和对照组小鼠1只,取十二指肠、空肠和回肠标本制备石蜡切片,并作RNA原位杂交。光学显微镜观察原位杂交切片,随机选取50个视野,计数所有观察视野内的虫体总数并计算平均数。 结果 侵入的弓形虫速殖子可位于小肠上皮细胞（吸收细胞、杯状细胞和内分泌细胞）的纹状缘、吸收细胞胞浆内或相邻吸收细胞间及固有层内。感染后15 min,黏附于空肠的速殖子数量（4.93±3.949）显著高于回肠（3.78±3.102） （P<0.05）;侵入空肠的速殖子数量（4.92±4.164）显著高于十二指肠（4.10±3.532）和回肠（3.68±3.301） （P＜0.05）。随着感染后时间的延长,黏附于各肠段的速殖子数量逐渐减少,而侵入的数量逐渐増多。与感染后15 min相比,感染后8 h,黏附于十二指肠（2.32±3.039）、空肠（3.15±3.241）和回肠黏膜（2.59±3.028）的速殖子数量均显著减少（P<0.05）,而侵入十二指肠（8.92±8.955）、空肠（9.11±6.667）和回肠黏膜（9.15±10.192）的速殖子数量均显著增加（P<0.05）。 结论 弓形虫速殖子对其所黏附的小肠上皮细胞无严格的选择性,但其侵入小肠的部位具有选择性,空肠为速殖子侵入的易感部位。     

丝裂原蛋白激酶抑制剂U0126对刚地弓形虫侵入宿主细胞的影响

目的观察丝裂原蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases,MAPK)抑制剂对刚地弓形虫侵入宿主细胞的影响。方法以丝裂原蛋白激酶抑制剂U0126分别以不同浓度加入分孔培养的细胞中,于不同时间分别用吉氏染色和流式细胞仪(FCM)检测其宿主细胞感染速殖子的差异。结果吉氏染色检测在以U01261μM,10μM和100μM作用3小时下其感染率分别比对照组下降了20.22%(,P<0.01),52.91%(P<0.01)和75.27%(P<0.01);在作用6小时及9小时其感染率分别比对照组下降了32.88%(P<0.01),57.24%(P<0.01),79.21%(P<0.01)和41.26%(P<0.01),54.73%(P<0.01),80.80%(P<0.01)。FCM检测结果与之相似。结论U0126通过作用于MAPK信号传导途径而明显抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞。     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫脾淋巴细胞免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,脾T细胞亚群的动态变化。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用10μlPBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo 500UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,制备脾淋巴细胞悬液并涂片,免疫细胞化学法检测脾CD4 、CD8 T细胞亚群。结果攻击后第16、19天TSo IFN-γ组脾CD4 T细胞比率较第10天升高(P<0.05);脾CD8 T细胞第10、13、16、19天呈现较高水平;CD4 /CD8 比值第10、13天出现倒置。结论TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可激发系统免疫反应,提高其细胞免疫应答水平,增强脾CD8 T细胞的细胞毒作用,抵抗弓形虫感染。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。     

弓形虫速殖子抗原组分分析及其免疫反应性的比较研究

应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶联免疫印渍试验(ELIB)和酶联免疫吸附试验(ELISA),对四种不同地理株弓形虫-CN、RH、BH、HH速殖子细胞质、细胞膜和代谢抗原组分及株间抗原差异、免疫反应性进行比较研究。ELIB实验结果:RH株高免兔血清与四株细胞质抗原反应,分别出现10、7、4、6条显色的反应区带,其中在35～38kD处都出现极明显的反应区带;与四株细胞膜抗原反应,分别出现5、6、6、9条显色反应区带,其中在31～35kD处都出现极明显的反应区带;与四株代谢抗原反应,分别出现8、7、6、7条反应区带,其中在50kD处、100～108kD处都有明显反应区带。实验结果提示,高免兔血清与四株12种抗原反应结果所出现的区带存在不同程度差异。ELISA检测免疫比值(P/N)大小比较结果表明,无论是细胞质、细胞膜或代谢抗原,在检测人弓形虫抗体阳性血清时,HH、BH较CN、RH的免疫比值高,株间抗原免疫反应似存在一定差异。     

右旋松萝酸体外抗弓形虫速殖子的实验研究

目的 探索右旋松萝酸在体外抗RH株弓形虫速殖子的效果。 方法 实验设右旋松萝酸组、乙酰螺旋霉素组、二甲基亚砜（DMSO）组及生理盐水对照组,前两组分别再设4个浓度组,于1 ml弓形虫速殖子悬液（1×10⁶个/ml）中分别加入终浓度为5、10、25和50 μg/ml右旋松萝酸或乙酰螺旋霉素;后两组分别加入等体积的生理盐水和1％ DMSO;每组15管。作用1、2和4 h后,取弓形虫悬液涂片,台盼蓝染色,光镜观察记数。将各组作用4 h的弓形虫悬液洗涤后,接种昆明小鼠,作再转种试验,观察弓形虫速殖子复苏情况。同时将洗涤后的虫体接种于制备的SD大鼠心肌成纤维细胞,观察虫体侵袭力。 结果 10、25和50 μg/ml右旋松萝酸组作用4 h,弓形虫速殖子台盼蓝着色率达100％,部分虫体肿胀,两端变圆,细胞质内出现颗粒,细胞核深染。各浓度的乙酰螺旋霉素组弓形虫速殖子变化与右旋松萝酸组相似,仅50 μg/ml组作用4 h后台盼蓝着色率达100％。再转种试验结果显示右旋松萝酸组仅5 μg/ml组小鼠于接种后第8～9天死亡,腹腔液见大量弓形虫速殖子;其余各组小鼠大多存活至再次转种,且腹腔液均未见弓形虫速殖子。但乙酰螺旋霉素各浓度组小鼠均于接种后6～8 d死亡,腹腔液见大量虫体及假包囊。右旋松萝酸5 μg/ml组,弓形虫速殖子侵入大鼠心肌成纤维样细胞,会形成假包囊,其余组均为阴性。但乙酰螺旋霉素、生理盐水和DMSO组速殖子对大鼠心肌成纤维细胞均有不同程度感染。 结论 右旋松萝酸在体外有较强的抗弓形虫速殖子作用。     

激光对弓形虫速殖子的作用研究

本实验采用激光致弱弓形虫速殖子接种ICR小鼠腹腔,以期提高小鼠抗弓形虫感染的免疫保护力。结果表明：激光照射能够抑制虫体的繁殖和分裂能力。照射虫体免疫小且能诱导产生持续升高的IgG抗体。免疫民经弓形虫RH株攻击后,其发病和死亡时间延长,表现出部分的保护性免疫力。提示：激光对弓形虫速殖子的作用明显,可望在弓形虫病的治疗和预防中得到应用。     

刚地弓形虫RH株速殖子在HeLa细胞系体外培养的实验观察

目的 建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。 方法 ①将HeLa细胞（1×10⁴个）接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12 h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿（1×10⁴个/皿）,继续培养0.5～96 h,观察弓形虫速殖子在HeLa细胞内增殖情况;②将纯化的弓形虫速殖子接种于HeLa细胞后分为2组,一组于37 ℃分别培养24～120 h后,移入25 ℃培养120 h;另组于37 ℃培养48 h后,移入25 ℃分别培养72～168 h,观察不同温度和时间对弓形虫速殖子产率和活虫率的影响;③当培养的HeLa细胞80%发生细胞融合时更换速殖子培养液,同上法12 h后接种纯化的弓形虫速殖子进行培养,当80% HeLa细胞被感染增殖的弓形虫速殖子涨破时,收集、计数弓形虫速殖子,并用其感染（3×10⁶个/瓶）新的HeLa细胞,观察其连续传代情况;④每隔5代取弓形虫速殖子,腹腔接种昆明小鼠（3×10⁶个/只）,观察小鼠存活时间、评价该体外培养条件对弓形虫速殖子毒力的影响。 结果 接种弓形虫速殖子96 h后HeLa细胞均被感染及涨破,培养弓形虫速殖子30代（3～4 d为1代）增殖稳定,每代获得弓形虫速殖子1×10⁷～5×10⁷个,增殖5～20倍。各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为5.80～6.40 d, 毒力未见减弱(P>0.05)。HeLa细胞接种弓形虫速殖子,于37 ℃培养72 h后,移至25 ℃培养120 h,其产率高达40倍以上,活虫率为90%以上,仅残留极少量Hela细胞。 结论 刚地弓形虫RH株速殖子可在HeLa细胞中增殖并长期稳定传代。