肝细胞损伤的分子生物学机制

随着医学研究的不断进展,我们对各种肝脏疾病的病因有了更加深入的了解,对疾病的治疗也渐渐从对症治疗转移到病因治疗,但是,在强调病因学治疗的同时,不应忽略对肝细胞的保护,因为肝细胞损伤是各型肝病共同的病理基础,是各种原因引起肝脏疾病的共同的表现.     

体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件，建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系，探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性。方法获取小鼠骨髓干细胞，建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测肝细胞特异性基因的表达。Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况。糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能。结果在诱导培养12d，可以观察到多极性的肝细胞样细胞。且细胞逐渐增多、集落不断增大。诱导细胞在培养7d开始表达AFP mRNA并维持到第21天。此后表达逐渐减弱；培养7天开始表达ALB mRNA和CK18 mRNA。随着培养时间的延长表达不断增强；培养14d开始表达TTR mRNA，随着培养时间的延长表达不断增强。通过Western blot检测，诱导21d的细胞表达ALB和CK18蛋白，流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60．45％，CK18阳性细胞的比例为67％。诱导培养21d，细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒；诱导培养6d，细胞开始合成尿素，尿素合成功能随诱导时间的延长而增强，于第15天达到高峰。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞。     

肝卵圆细胞经脾脏移植治疗肝纤维化的实验研究

目的研究肝卵圆细胞在治疗肝纤维化的有效性。方法用携带GFP转基因C57BL／6小鼠,喂0．1％的3,5-二乙酯基-1,4二氢三甲基吡啶（DDC）,刺激卵圆细胞增生,再两步酶灌注法和Sea-1抗体标记的免疫磁珠分选法加以分离出携带有GFP的SCa-1＋细胞。利用皮下注射CCI。的方法,建立小鼠肝纤维模型。根据不同的组别经脾分别输入卵圆细胞或生理盐水。4周后观察肝功能各项指标及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。结果经脾脏移植后卵圆细胞入肝后主要定植与汇管区。移植后肝功能指标均有不同程度改善,纤维化程度有所减轻,尤以停止注射四氯化碳组明显。结论携带GFP的基因卵圆细胞经脾注射至肝纤维化小鼠体内后,可定植于受者肝脏内,并可缓解肝硬化的进展,促进肝纤维的逆转。     

氢醌对人L-02肝细胞泛素连接酶Rad18表达的影响

目的 研究氧醌(hydroquinone,HQ)对人L-02肝细胞中泛素连接酶Pad18表达的影响,探讨Rad18在HQ所致肝细胞毒性中的作用及其可能机制.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160 μmol/L)的HQ作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率;用单细胞凝胶电泳检测DNA损伤情况;实时荧光定量PCR技术检测Rad18在mRNA水平上的表达;Western blot方法检测Pad18在蛋白质水平上的表达.结果 在0-80 μmoFL的范嗣内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响,当染毒剂量超过160 μmol/L时,细胞存活率(79.20%)明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).随着 HQ作用浓度的升高,L-02肝细胞的Olive尾矩也逐渐增加,呈线性正相关关系(r=920,P<0.01).在HQ染毒剂量低于40μmol/L的范围内,Rad18在mRNA和蛋白质水平上的表达均有随着剂量的增加而增加的趋势;当HQ的剂量超过40 μmol/L时,Pad18在mRNA水平上的表达继续增加,而其在蛋白质水平上的表达则无明显变化.结论 HQ可使L-02肝细胞的Rad18表达增加.     

乙型肝炎体外实验模型的方法学研究

目的 本研究拟在原有体外模型,如体外鸭原代肝细胞培养模型、大鼠原代肝细胞培养和HBV基因转染人肝癌细胞系-2215细胞培养模型的基础上,对相关实验方法和内容进行改进,以便为防治乙肝药物的应用研究提供比较理想的实验方法.方法 根据乙型肝炎的病症和乙肝病毒感染的特点,分别以嗜肝DNA病毒感染鸭的原代肝细胞、HBV基因转染人肝癌细胞系-2215细胞和CCl4熏染大鼠原代肝细胞体外培养试验,观察肝原代细胞培养后的存活状态、DHBV-DNA和ALT的水平.结果 受染后的鸭、2215细胞和鼠原代肝细胞存活时间较未染细胞明显缩短,DHBV-DNA和ALT的水平显著升高.结论 改进后的乙肝鸭原代肝细胞培养、CCl4熏染大鼠原代肝细胞培养和人肝癌2215细胞体外培养模型稳定,重复性好,适用于防治乙型肝炎有效药物的筛选和研究.     

肝脏中糖代谢关键酶作为糖尿病药物靶点的研究进展

葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶和糖原磷酸化酶是肝脏中精代谢的关键酶.糖尿病的一个特征就是葡萄糖激酶活性下降和葡萄糖-6-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、果糖-1,6-二磷酸酶和糖原磷酸化酶活性的升高.最近的研究都致力于通过激活或抑制这儿种酶来降低血糖并使胰岛素正常分泌.因此这5种酶将有可能是治疗糖尿病的全新靶点.     

瑞芬太尼对大鼠肠缺血再灌注时肝细胞凋亡的影响

目的 评价瑞芬太尼对大鼠肠缺血再灌注时肝细胞凋亡的影响.方法 成年Wistar大鼠54只,随机分为3组(n=18):假手术组(S组)、肠缺血再灌注组(IIR组)和瑞芬太尼组(R组).IIR组及R组采用夹闭肠系膜上动脉1 h后再灌注的方法制备肠缺血再灌注模型,R组于缺血前10min开始静脉输注瑞芬太尼1 μg·kg-1·min-1至再灌注末,S组及IIR组给予等容量生理盐水.分别于再灌注1、3、6 h时处死6只大鼠,取肝组织,检测肝组织Bcl-2与Bax表达水平及肝细胞凋亡情况,计算肝细胞凋亡指数(AI).结果 与S组相比,IIR组和R组Bcl-2与Box表达上调,肝细胞AI升高,IIR组Bcl-2/Bax比值降低,R组Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05);与IIR组相比,R组Bcl-2表达、Bcl-2/Bax比值升高,Box表达下调,肝细胞AI降低(P<0.05).结论 瑞芬太尼可抑制大鼠肠缺血再灌注时肝细胞凋亡,其机制与上调Bcl-2表达及抑制Bax表达上调有关.     

肝再生增强因子对大鼠腹腔移植的肝细胞的影响

目的 探讨肝再生增强因子(ALR)对急性肝功能衰竭大鼠腹腔移植的肝细胞的影响.方法 采用D-氨基半乳糖诱导SD大鼠急性肝功能衰竭(AHF),然后将其随机分为空白对照组(仅接受生理盐水腹腔注射)、移植对照组(腹腔移植SD大鼠的肝细胞2×107个)、环孢素A组(CsA组,接受肝细胞移植后腹腔注射CsA 6 d)、ALR组(接受肝细胞移植后腹腔注射ALR 6 d)和ALR对照组(仅腹腔注射ALR 6 d).实验期为14 d,观察受者的存活情况及移植肝细胞存活情况,检测腹腔内细胞CD4、CD8及CD68的表达情况,测定血清及腹腔冲洗液中自细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子a(TNF-a)的水平.结果 空白对照组、移植对照组、CsA组、ALR组及ALR对照组的受者2周存活率分别为0、46.7%、20%、66.7%和14.3%,ALR组显著高于空白对照组(P=0.001).移植后1～2 d,ALR组血清TNF-a和IL-1β明显低于空白对照组和移植对照组(P<0.01);移植对照组腹腔冲洗液中TNF-a和IL-1β水平明显高于其它各组(P<0.05,P<0.01).至移植后14 d,各组存活大鼠的血清TNF-a和IL-1β水平接近正常水平.移植后1～2 d,ALR组移植物内CD68表达水平为(0.5±0.3)%,明显低于移植对照组和CsA组(P<0.01);ALR组腹腔内细胞CD68、CD4及CD8表达水平分别为(1.3±1.2)%、(0.1±0.3)%和(0.2±0.1)%,均明显低于移植对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05).移植后1～3 d,接受肝细胞移植的大鼠腹腔内可见聚集成团的肝细胞结节,ALR组存活的肝细胞数明显多于移植对照组和CsA组,且炎症细胞浸润较少,至移植后14 d,仅ALR组可见少量形态正常的肝细胞.结论 腹腔内肝细胞移植联合ALR腹腔注射能提高AHF大鼠的存活率;ALR能短期改善移植肝细胞的存活状况.